肝癌患者血清乙肝病毒e抗原与肝细胞HBV cccDNA水平的相关性

我国原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)男性及女性病死率在所有恶性肿瘤中分别排第4和第5位[1-2]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC的重要病因之一[3]，与血清HBV DNA阴性肝炎患者相比，当HBV DNA>20 000 U/mL时，患者发生肝硬化和HCC的风险分别增加10倍和9倍[4]；同时肝癌患者HBV复制水平与患者预后密切相关，高HBV DNA水平HCC患者预后更差、更易复发[5]。抗病毒治疗可以降低病毒携带者HCC发生率[6]，并显著改善HCC患者预后[7]。因此，监测HCC患者HBV复制水平对于指导肝癌患者的抗病毒治疗具有重要的临床意义[8]。

肝细胞内HBV病毒基因组包括松弛环状DNA(relax circular DNA，rcDNA)和共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA, cccDNA)，其中cccDNA是HBV复制的原始模板，肝细胞cccDNA定量是评价抗病毒药物疗效的金指标[9]。近年来，临床研究[10]和体外研究[11]均表明慢乙肝患者HBeAg与cccDNA具有良好的相关性。因此，本研究主要探讨HCC患者血清HBeAg与肝细胞HBV DNA及cccDNA的关系，并使用血清学指标构建预测组织HBV DNA及cccDNA的多元回归模型，为更好地评价HCC患者肝细胞HBV DNA及cccDNA水平提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择 收集2012～2015年在解放军第105医院接受肝癌切除术的HCC患者96例，HCC患者癌组织及癌旁组织均术中收集并保存于-80℃冰箱备用，癌旁组织为距离癌组织切缘2～3 cm切下的约0.5 cm3的样本。本研究经解放军第105医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。纳入标准：所有HCC患者均经组织病理确诊，同时满足HBsAg阳性，血清HBV DNA>1 000 U/mL，无抗病毒用药史。排除标准：合并或其他肝炎病毒(如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等)感染、肝移植、血液病或其他实体肿瘤。

1.2 血清标志物检测 使用雅培i2000全自动化学发光分析仪(Abbott，美国)及其配套试剂[Abbott,美国；试剂批号：乙肝表面抗原(43417LF00)，乙肝表面抗体(37323LF00)，HBeAg(34833LI00)，HBeAb(33798LI00)，乙肝核心抗体(33674LI00)]检测HBV感染标志物。

1.3 血清HBV DNA及肝细胞HBV DNA、cccDNA检测 使用QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN，德国)提取血清及组织HBV DNA，使用ABI 7500荧光定量PCR仪(Life Technologies Corporation，美国)检测血清HBV DNA及组织cccDNA。定量检测方法参考文献[12]，使用质粒安全ATP依赖的NDA酶处理肝细胞总DNA，获得HBV DNA及cccDNA，使用Taqman荧光探针PCR法检测HBV DNA及HBV cccDNA，使用引物F1和R1，TaqMan探针P1，对组织HBV cccDNA进行定量，使用引物F2和R2，TaqMan探针P2对组织HBV DNA进行定量。组织内HBV DNA和cccDNA定量均参考组织甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GADPH)定量进行标准化[13]，各引物序列详见表1。

表1 肝细胞HBV DNA及cccDNA定量检测引物列表

1.4 分组及观察指标 根据HBV感染阶段将HCC患者分成3组：HBeAg(﹢)/HBeAb(-)组、HBeAg(﹢)/HBeAb(﹢)组及HBeAg(-)/HBeAb(﹢)组，比较3组血清、肝癌组织及癌旁组织HBV DNA及cccDNA水平的差异。

2 结果

2.1 不同HBV感染阶段HCC患者组织HBV DNA及cccDNA水平比较 不同HBV感染阶段HCC患者年龄、性别存在差异，但各组肿瘤病理学指标差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。HBeAg(+)/HBeAb(-)组血清HBV DNA、癌旁组织HBV DNA及cccDNA水平高于HBeAg(-)/HBeAb(+)组(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(-)组癌旁组织cccDNA高于HBeAg(+)/HBeAb(+)组(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(+)组癌组织中HBV DNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)组(P<0.05)。详见表3。

表2 不同HBV感染阶段HCC患者基本信息

指标HBeAg(+)/HBeAb(-)组(n=20)HBeAg(+)/HBeAb(+)组(n=18)HBeAg(-)/HBeAb(+)组(n=58)F值P值癌组织cccDNA(log10U/106cells)3.4±1.64.5±1.63.5±1.4#3.8190.026癌组织HBVDNA(log10U/106cells)5.7±0.86.0±1.25.5±1.42.8490.063癌旁组织cccDNA(log10U/106cells)5.4±1.34.1±1.2*4.2±0.9*5.7830.004癌旁组织HBVDNA(log10U/106cells)7.0±1.56.3±1.25.7±1.0*6.2310.002血清HBVDNA(log10U/mL)5.5±1.15.0±1.04.5±1.0*13.389<0.001

2.2 肝癌患者血清HBeAg与组织HBV DNA及cccDNA的关系 HCC患者血清HBeAg与癌旁组织 HBV DNA(r=0.476，P<0.001，图1A)及cccDNA(r=0.549，P<0.001，图1C)存在相关性，与癌组织HBV DNA(r=0.064，P=0.540)、癌组织cccDNA(r=0.132，P=0.219)无相关性。同时血清HBV DNA与癌旁组织 HBV DNA(r=0.440，P<0.001，图1B)及cccDNA(r=0.359，P<0.001，图1D)存在相关性，但与癌组织中HBV DNA(r=0.047，P=0.652)及cccDNA(r=0.129，P=0.230)无相关性。详见图1。

图1 HCC患者血清HBeAg、HBV DNA与肝细胞组织HBV DNA和cccDNA的相关性

2.3 不同TNM分期肝癌HBeAg与组织HBV DNA及cccDNA关系 肝癌患者血清HBeAg与癌旁组织中cccDNA 和HBV DNA均存在相关性(P<0.05)，与癌组织cccDNA及HBV DNA水平无相关性(P>0.05)，而血清HBV DNA仅在TNM I期及III期患者与癌旁组织cccDNA及HBV DNA存在相关性(P<0.05)。详见表4。

2.4 癌旁组织HBV DNA及cccDNA的预测模型构建 使用血清学指标利用多元回归模型预测癌旁组织HBV DNA及cccDNA，使用HBeAg、血清HBV DNA及乙肝核心抗体(hepatitis B core antibody，HBcAb)可以预测癌旁组织HBV DNA(R2=0.549)及cccDNA(R2=0.542)，回归方程为：癌旁组织HBV DNA= 5.422+ 0.551×血清HBV DNA+0.308×HBeAg+0.239×HBcAb，癌旁组织cccDNA=0.525+0.439×血清HBV DNA+0.436×HBeAg+0.168×HBcAb。详见表5。

3 讨论

HBV cccDNA 是HBV前基因组RNA(pregenome mRNA, pgmRNA)复制的原始模板，是HBV循环复制以及持续感染的关键因素[14]。现有核苷(酸)类似物无法直接作用于cccDNA，肝细胞cccDNA的存在是HBV病毒难以清除的关键因素[15]，故肝细胞cccDNA水平对于HCC患者抗病毒治疗的监测具有重要意义。但由于肝活检监测肝组织中cccDNA水平还存在一定的困难，故探讨能反映其水平的非侵入性替代检测指标具有重要意义。

表4 不同分期HCC患者血清HBeAg、HBV DNA与肝HBV DNA相关性分析

表5 癌旁组织HBV DNA和cccDNA的多元回归分析

本研究中，不同感染阶段HCC患者血清HBV DNA、癌旁组织HBV DNA及cccDNA水平存在差异，HBeAg(+)/HBeAb(-)组高于HBeAg(-)/HBeAb(+)组，且随着患者免疫状态由HBeAg阳性向阴性转换而降低；HBeAg(+)/HBeAb(-)组HCC患者癌旁组织中cccDNA水平高于HBeAg(+)/HBeAb(+)组，而HBeAg(+)/HBeAb(+)组与HBeAg(-)/HBeAb(+)组癌旁组织cccDNA水平无显著改变，这与相关研究[10-11，16]结果一致，表明进入血清转换状态后，患者cccDNA水平趋于稳定。HBeAg(+)/HBeAb(+)组患者癌组织中HBV DNA和cccDNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)组，表明在不同感染阶段，癌组织与癌旁组织HBV DNA的变化还受病毒所处组织微环境的影响。

HBV复制周期中，以cccDNA为模板合成pgmRNA，其前C/C区既是HBcAg的模板，也是HBeAg合成的模板[17]，故cccDNA水平直接决定了HBcAg及HBeAg的水平。本研究表明，HCC患者中HBeAg与癌旁组织HBV DNA和cccDNA有相关性，HBeAg与癌组织中HBV DNA和cccDNA水平无相关性，可能原因包括：①血清HBeAg主要源于癌旁组织，癌旁组织反映的是整个肝脏的状况，而癌组织仅占肝脏的较小部分；②这可能与乙肝相关肝癌时期病毒复制周期改变有关，在慢乙肝患者或癌旁组织中，乙肝病毒基因复制、成熟及分泌整个过程有条不紊，HBV DNA复制水平与前C/C基因表达水平较为一致，而在癌组织，这种一致性很可能被打破[17]，从而表现为HBeAg与癌旁组织中指标呈相关性，而与癌组织中指标无相关性。近年来，乙肝c相关抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg )被证明与乙肝患者肝内cccDNA具有较好的相关性[18-19]，但其临床应用仍然有限，相比而言，HBeAg检测应用更为广泛，更便于临床应用。

此外，本研究进一步分析了不同TNM分期HCC患者HBeAg与组织HBV DNA及cccDNA的相关性，结果表明，HBeAg均与癌旁组织HBV DNA和cccDNA显著相关，尽管TNM I期与III期患者血清HBV DNA与组织HBV DNA和cccDNA相关系数更高，但II期患者血清HBV DNA与癌旁组织HBV DNA和cccDNA无相关性，表明血清HBeAg水平对于组织HBV DNA和cccDNA水平的监测具有较好的稳定性。

最后，我们使用了HBV感染的血清学指标构建了癌旁组织HBV DNA及cccDNA的预测模型，可以预测癌旁组织HBV DNA及cccDNA的变化，R2分别为0.549及0.542，表明上述指标与组织HBV DNA均具有一定的相关性，本研究中血清HBV DNA与HBeAg均与癌旁组织HBV DNA及cccDNA有相关性，而HBcAb与癌旁组织HBV DNA及cccDNA无相关性。但既往研究[20]表明，HBcAb可单独预测HBeAg血清转换，与cccDNA具有相似的意义，故进入了组织HBV DNA的预测模型，同时使用多变量回归模型预测癌旁组织HBV DNA及cccDNA优于使用单个指标(单独使用血清HBV DNA及HBeAg预测时，R2均<0.4)，未来纳入更多变量时，其预测效果可进一步提高。

综上所述，不同HBV感染阶段HCC患者其癌旁组织HBV DNA和cccDNA水平差异有统计学意义，血清HBeAg及HBV DNA与癌旁组织HBV DNA和cccDNA具有较好的相关性，且血清HBeAg与癌旁组织HBV DNA和cccDNA显著相关，不受TNM分期影响，使用血清学指标构建的组织HBV DNA和cccDNA回归模型，可用于预测组织HBV DNA和cccDNA变化，更易于临床检测，故可以更好地监测HCC患者HBV感染状况，为HCC患者抗病毒治疗提供更多指导。

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