黄芩苷在Nb2O5-石墨烯纳米复合材料修饰电极上的电化学行为及测定

瞿万云， 吴 艳,2， 胡卫兵

(1.湖北民族学院化学与环境工程学院,湖北恩施 445000；2.湖北民族学院生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北恩施 445000)

黄芩苷(Baicalin,Bai)是中药黄芩(RadixScutellariae)中主要的活性成分之一，它具有抗菌、消炎、镇静解热和抗癌等作用。研究表明，黄芩苷在低于细胞毒浓度时可抑制T细胞和艾滋病病毒，因此有望开发成为新的抗艾滋病药物。目前，许多含黄芩的中药复方制剂均采用黄芩苷作为质量控制的指标。因此，黄芩苷的测定在药物质量控制上十分重要。已报道测定黄芩苷的方法主要有高效液相色谱法[1]、毛细管电泳法[2]和电化学方法[3 - 6]等。其中，电化学分析方法以其仪器简单、检测快速、灵敏度高等优点受到广泛研究。

石墨烯凭借优良的电子传输能力、大的比表面积以及良好的生物相容性，已广泛应用于电分析化学领域[7 - 8]。石墨烯基复合材料借助不同材料的协同作用，具有更快的电子迁移率、更大的比表面积和更好的生物相容性。近年来，以石墨烯作为载体材料，合成石墨烯-金属纳米粒子和石墨烯-金属氧化物复合材料，用于电化学和生物传感领域的报道越来越多。例如，MnO2-石墨烯[9]、ZnO-石墨烯[10]、TiO2-石墨烯[11]、WO3-RGO[12]等。Nb2O5耐酸碱腐蚀性强，具有稳定优越的电化学性能[13]，Nb2O5-石墨烯(Nb2O5-RGO)纳米复合材料用于黄芩苷的检测尚未见报道。

本文采用一步溶剂热法合成Nb2O5-RGO纳米复合材料，并用其作修饰剂制备Nb2O5-RGO修饰玻碳电极。详细研究了黄芩苷在该修饰电极上的电化学行为，发现Nb2O5-RGO修饰电极对黄芩苷具有良好的电催化活性。基于此，建立了黄芩颗粒制剂中黄芩苷的检测新方法，为提高含黄芩的中药复方制剂的质量控制提供一定的实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:工作电极为玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)或修饰电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝电极；JSM-650LV型扫描电子显微镜(日本，电子株式会社)。

黄芩苷(中国药品生物制品检定所)标准溶液：准确称取一定量黄芩苷溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，配制成1.0×10-2mol·L-1的储备液，置于冰箱中避光保存，使用时适当稀释；鳞片石墨(>99.98%，国药集团化学试剂有限公司)；NbCl5(99.99%，Sigma-Aldrich公司)；双十六烷基磷酸(DHP，Fluka公司)。其他试剂均为分析纯，所有试剂未经纯化直接使用。实验用水为二次蒸馏水。

黄芩颗粒(某制药有限公司)。

1.2 Nb2O5纳米棒、RGO和Nb2O5-RGO材料的制备

用鳞片石墨为原料，采用改进的Hummers方法[14]制备氧化石墨。称取100 mg氧化石墨于50 mL二次蒸馏水中，超声30 min后，离心分离即得氧化石墨烯(GO)分散液。

将25 mg NbCl5用少量无水乙醇溶解。把上述GO分散液和NbCl5乙醇溶液加入到100 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中，反应釜置于不锈钢外壳中拧紧盖好，于235 ℃保温72 h，得到黑色的Nb2O5-RGO复合材料。同时，分别将单一的GO分散液和NbCl5乙醇溶液转入到100 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中，于235 ℃保温72 h，得到黑色的RGO悬浮液[15]和Nb2O5纳米材料[13]。上述产物分别用水、乙醇和丙酮各离心洗涤三次，60 ℃真空干燥得到Nb2O5-RGO、RGO和Nb2O5粉末。

1.3 修饰电极的制备

将4 mg Nb2O5-RGO和2 mg DHP加至4 mL水中，超声分散40 min直至得到均一、黑色的悬浮液。GCE用粒径为0.05 μm的Al2O3抛光粉进行抛光，冲洗干净后分别在无水乙醇、水中各超声清洗2 min，红外灯下烘干。取10 μL上述Nb2O5-RGO分散液滴加至GCE表面，红外灯下挥发掉溶剂即得到Nb2O5-RGO/DHP/GCE。Nb2O5-DHP/GCE和RGO-DHP/GCE参照上述方法制备。

1.4 实验方法

修饰电极先在10 mL pH=2.1的B-R缓冲溶液中循环伏安扫描(扫描范围为0.0～1.0 V)，直至循环伏安曲线稳定。然后，加入一定量的黄芩苷标准溶液，在搅拌条件下开路富集2 min，静止15 s，在0.1～0.9 V之间进行循环伏安(CV)、线性扫描伏安(LSV)和差分脉冲伏安(DPV)实验。

2 结果与讨论

2.1 Nb2O5和Nb2O5-RGO材料的表征

用扫描电子显微镜(SEM)对制备的Nb2O5和Nb2O5-RGO材料进行表征，见图1。从图1a中可以看出Nb2O5纳米棒的形貌；由图1b可以清晰看到在RGO里分散有Nb2O5纳米棒，且纳米棒长度为2.1 μm左右，直径为400 nm左右。

图1 Nb2O5(a)和Nb2O5-RGO(b)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM image of Nb2O5 (a) and Nb2O5-RGO(b)

图2 黄芩苷在不同电极上的循环伏安图 Fig.2 Cyclic voltammograms of the different modified electrodes in 5.0×10-6 mol·L-1 baicalin solutiona:Nb2O5-RGO/DHP/GCE in pH=2.1 B-R buffer solution without baicalin;b:Nb2O5-RGO/DHP/GCE;c:bare GCE;d:Nb2O5-DHP/GCE;e:RGO-DHP/GCE.scan rate:0.1 V·s-1；t=120 s .

2.2 黄芩苷在Nb2O5-RGO-DHP/GCE上的电化学行为

黄芩苷在不同电极上的CV曲线见图2。在0.1 V到0.9 V的扫描范围内，黄芩苷在RGO-DHP/GCE(内插图曲线e)上没有观察到电化学响应信号；在裸GCE(内插图曲线c)和Nb2O5-DHP/GCE(内插图曲线d)上开路富集2 min后出现较小的氧化峰，说明这两种电极对黄芩苷的电化学氧化活性较低；在Nb2O5-RGO/DHP/GCE(曲线b)上出现了一对灵敏的氧化还原峰(曲线a是Nb2O5-RGO/DHP/GCE在空白B-R缓冲溶液中)，峰电位差为45 mV，峰电流之比(Ipa/Ipc)为2.29，表明黄芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE上的反应为准可逆的电化学过程；而氧化峰电位比在裸GCE上正移了13 mV，氧化峰电流增大约18倍，说明Nb2O5-RGO复合材料能显著增强黄芩苷的电氧化活性。这可能是由于Nb2O5纳米棒分散在RGO里时阻止了氧化石墨烯在还原过程中的团聚和堆叠，使复合材料具有较大的比表面积，为黄芩苷的氧化提供了较多的反应位点；也有可能是复合材料中的RGO和Nb2O5产生了协同效应，有效促进了电子的传输速率，从而提高了黄芩苷的电氧化活性。另外，随着扫描次数的增加，氧化峰电流逐渐降低，最后趋于稳定；还原峰随扫描次数增加略有降低，说明黄芩苷及其氧化产物在修饰电极上均有吸附。因此，为了得到更好的灵敏度和重现性，选择第一圈的氧化峰作为研究对象。

2.3 影响黄芩苷电化学行为的因素

2.3.1测定介质及pH值的影响用CV法研究了黄芩苷在HClO4、NaAc-HAc缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、B-R缓冲溶液和NaOH溶液(浓度均为0.1 mol·L-1)中的电化学行为。实验发现，黄芩苷在碱性溶液中无峰出现，在酸性溶液中有明显的氧化峰出现，且在B-R缓冲液中的峰形较好，峰电流较大。在B-R缓冲溶液中，用LSV法研究了pH值对黄芩苷氧化峰电流的影响。发现pH在1.98～2.21范围内，黄芩苷的氧化峰电流几乎不变；当pH值继续增加时，氧化峰电流逐渐减小。所以实验选择pH=2.1的B-R缓冲溶液为测定介质。另外，随着pH的增加，黄芩苷的氧化峰电位逐渐负移，这表明质子参与了黄芩苷的氧化过程。峰电位与pH值的关系为:EP(V)=0.5742-0.04871pH(R=0.9930),斜率48.71 mV/pH,说明参加氧化反应的电子数和质子数之比为1，这与文献报道[4 - 5]的结果相似。

2.3.2扫描速率的影响用CV法考察了扫描速率对黄芩苷峰电流的影响，见图3。黄芩苷在修饰电极上的氧化还原峰电流都随扫速的增加而增大，而且在0.025～0.25 V·s-1范围内，氧化峰电流(Ip)与扫速(v)呈良好的线性关系(图3插图)，线性回归方程为：Ip(μA)=2.5593+57.3319v(V·s-1)(R=0.9947)，表明黄芩苷在此修饰电极上的反应是受吸附控制的。当扫速为0.1 V·s-1时信噪比最好，所以本实验选择扫速0.1 V·s-1。

另外，黄芩苷的氧化还原峰电位也随扫速的改变而改变。随扫速的增加，黄芩苷的氧化峰电位正移而还原峰电位负移，说明黄芩苷的氧化还原可逆性随扫速的增大而变差。氧化峰电位与扫速的线性关系为：Ep(V)=0.5101+0.01561lnv(V·s-1)(R=0.9953)。对于受吸附控制的非可逆反应,氧化峰电位(Ep)与扫描速度(v)遵循以下关系式：Ep=E0+(RT/anaF)ln(RTk0/αnaF)+(RT/αnaF)lnv,Ep的斜率为RT/αnaF，其中na为转移电子数，α为电子转移系数，对于非可逆过程，α通常取0.5，由此求出na=1.7。故有两个电子参与电极反应，与文献报道[4 - 5]的结果一致。

2.3.3Nb2O5-RGO用量的影响Nb2O5-RGO的用量对黄芩苷的氧化峰电流有很大的影响。当Nb2O5-RGO分散液的量从0逐渐增加到10 μL时，黄芩苷的氧化峰电流显著增加；从10 μL增加到15 μL的过程中，黄芩苷的氧化峰电流没有明显变化；继续增加Nb2O5-RGO分散液的量，则峰电流反而降低。可能是因为此时电极表面的DHP太多，降低了电极表面膜的导电性能，从而阻碍了黄芩苷与电极之间的电子交换。因此实验选择Nb2O5-RGO分散液的用量为10 μL。

2.3.4富集时间和富集电位的影响分别试验了开路富集和闭路富集(富集电位-0.2～0.2 V范围)情况下富集时间对黄芩苷氧化峰电流的影响。结果发现，峰电流随富集时间的增加而增大，在相同富集时间条件下，开路富集的峰电流大于闭路富集的峰电流，故实验选择开路富集。在开路富集条件下，对不同浓度的黄芩苷溶液进行了搅拌富集时间试验。实验发现，浓度为5.0×10-7mol·L-1的溶液富集3 min后峰电流达到最大值，而浓度为2.0×10-6mol·L-1的溶液富集2 min后就达到最大峰电流。说明黄芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE电极表面发生了吸附，浓度较小的溶液达吸附平衡所需时间较长。

2.4 线性方程和检出限

图4 不同浓度黄芩苷的差分脉冲伏安曲线Fig.4 Differential pulse voltammograms of different concentrations of baicalin at Nb2O5-RGO/DHP/GCEcBai(a-j):0.05,0.1,0.5,0.7,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 mol·L-1.pH=2.1 B-R buffer solution;scan rate:40 mV·s-1.

在上述优化条件下，用DPV法(脉冲振幅50 mV，电位增量4 mV，脉冲宽度0.04 s)考察了黄芩苷的氧化峰电流与其浓度的关系，见图4。黄芩苷的氧化峰电流(IP)与其浓度(c)在5.0×10-8～1.0×10-6mol·L-1和1.5×10-6～1.0×10-5mol·L-1范围内有良好的线性关系，其线性回归方程分别为：Ip(μA)=0.05846+7.8268c(c,μmol·L-1)(R=0.9979)；Ip(μA)=7.8237+2.5321c(c,μmol·L-1)(R=0.9978)，开路条件下富集3 min后，黄芩苷的检出限(S/N=3)为1.5×10-8mol·L-1。

2.5 稳定性、重现性和选择性

在最佳条件下，对1.0×10-6mol·L-1黄芩苷溶液平行测定5次的相对标准偏差(RSD)为4.6%；用5支修饰电极分别测定1.0×10-6mol·L-1的黄芩苷溶液，其RSD为4.8%，说明修饰电极具有良好的重现性。将制备好的修饰电极在4 ℃冰箱中分别放置1、2、4 d后再进行测定，其氧化峰电流分别降低1.6%、3.5%、8.2%，说明该修饰电极有好的稳定性。

在此体系中研究了一些常见金属离子和有机物对黄芩苷测定的影响。1.0×10-3mol·L-1Zn2+、K+、Cu2+、Fe2+、Ca2+；1.0×10-5mol·L-1乳酸、尿酸、抗坏血酸、葡萄糖等几乎不干扰2.0×10-6mol·L-1黄芩苷的测定(误差<5%)。说明修饰电极有好的选择性。

2.6 样品分析及回收率的测定

取不同批号(批号：501640L、501630L、501644L)的黄芩颗粒制剂，分别研成细粉。称取约0.5 g，精密称定，用70%乙醇超声提取两次(每次20 mL，超声30 min)，提取液过滤后置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀。取一定体积的样品溶液加入到10 mL电解池中，在最佳条件下进行DPV测量。通过计算求得黄芩颗粒中黄芩苷含量分别为6.95%、7.12%和7.03%，平均值为7.03%。在该制剂中加入一定量的黄芩苷标准溶液，按上述方法提取，提取液在优化条件下连续测定4次，结果见表1。其回收率在93.0%～95.1%之间。

表1 黄芩苷的回收率测定结果(n=4)Table 1 Recovery results of baicalin in samples(n=4)

3 结论

本文用一步溶剂热法制备了Nb2O5-RGO纳米复合材料，制作了Nb2O5-RGO/DHP/GCE，用于黄芩苷的灵敏检测。与裸GCE相比，黄芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE上的氧化峰电流显著增强。Nb2O5-RGO/DHP/GCE有良好的稳定性和选择性，对黄芩苷的检测具有较宽的线性范围。可用于黄芩颗粒制剂中黄芩苷的测定。

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