不同介入时间电针治疗对脑缺血后脑组织Bax、Bcl-2表达及PI3K/AKT信号通路的影响*

刘 洁, 王宝亮, 钱仁义

河南中医药大学第一附属医院脑病科(郑州450000)

脑梗死发病率、致残率高，我国每年约有160万人死于此病。虽然现已确立了超早期溶栓治疗的有效性，但国际上的溶栓治疗时间窗严格限制在3～4.5 h内[1]。电针即将电刺激与传统中医的针灸相结合，被广泛应用于脑卒中临床及其机制研究动物模型中。研究表明，电针能有效减少脑水肿的形成及脑梗死的面积，并能改善脑血流的分布及对大脑有明显的神经保护作用[2]。PI3K/AKT信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，同时大量实验中发现其在神经系统疾病中参与细胞增殖、分化、代谢等生物学活动[3-4]。因此本研究通过建立MCAO模型给予不同介入时间的电针治疗来阐明脑梗死后电针治疗最佳时间窗及其可能机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：健康的SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠126只，由我院实验动物中心提供，大鼠年龄大概在8周至10周，体重在250～280 g范围内，自由取食，2只大鼠共住一笼，在无菌的层流通风的动物饲养房中饲养，合格证号：SCXK(湘)2015-0004。实验操作部分在我院医学科学研究中心进行。

1.2 实验试剂：苏木素染色剂 Sigma 公司；一抗，兔抗大鼠Anti-VEGF(血管内皮因子抗体)，北京博奥森生物公司；二抗，羊抗兔IgG 抗血清，北京博奥森生物公司；即用型SABC 免疫组化试剂盒，武汉博士德生物公司；DAB染色试剂盒，南京凯基生物公司；其他免疫组化试剂,福州迈新生物公司；定量PCR试剂盒，Invitrogen Life Technologies公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒，武汉谷歌生物技术有限公司；蛋白抽提试剂盒，武汉谷歌生物技术有限公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术研究所生产；超敏ECL 化学发光试剂盒BeyoECL Plus 碧云天生物技术研究所生产；其余试剂均为国产分析纯。

2 方 法

2.1 动物分组:SD 大鼠随机分为为缺血组(CI)h 和假手术组(Sham)。缺血组参照Zea Longa[5]线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血再灌注模型，假手术组仅暴露右侧颈总动脉，不予阻断血流。缺血组随机分为模型组、模型干预组(1 h后开始电针组、6 h后开始电针组、12 h后开始电针组、24 h后开始电针组、48 h后开始电针组)。

2.2 建立大鼠MCAO模型:健康成年雄性 SD 大鼠，体重250～ 280g，适应性饲养1周后参照Zea-Longa 线栓法[15]制作右侧大脑中动脉栓塞模型(MCAO model)。

2.3 大鼠MCAO 模型神经功能缺损评分:大鼠MCAO模型制作成功后，按Zea-Longa[6]标准进行大鼠脑缺血再灌注神经功能缺损评分，评分于大鼠脑缺血1.5 h再灌注1 h后进行。该标准根据大鼠神经损伤症状进行评分，标准如下：0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧(患侧)前爪；2分：向对侧(患侧)转圈；3分：向对侧(患侧)倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：动物死亡。其中评分为1～3分且无蛛网膜下腔出血的大鼠纳入实验，0分、4分和5分剔除，并随机补充。

2.4 选穴与治疗方法:穴位定位参照李忠仁《实验针灸学》[7]，“百会”穴位于头部，前发际正在直上5 寸，或两耳尖连线中点处；“水沟穴”位于面部，当人中沟的上13 与中13 交点处；“曲池”穴位于肘横纹外侧端，屈肘，尺泽与肱骨外上髁连线中点；“足三里”穴位于小腿前外侧，当犊鼻下3 寸，距胫骨前缘一横指(中指)。治疗方案：假手术组、模型组不予任何治疗处理，其余治疗组分别于缺血再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 开始行电针治疗，均1d1次，每次持续30 min，连续5 d。用32#1 寸针灸针，直刺以上四个穴位，深度约7 mm，快速捻转至针下沉涩感后，接韩式穴位神经刺激仪(HANS-200，南京济生医疗科技有限公司)，等幅疏密波，频率为2/100 Hz，电流强度2mA，以动物肢体微颤为度。具体操作方法: 两人配合操作，一人用手抓取SD 大鼠以固定，另一人做提插操作手法。模型组和假手术组的SD 大鼠与其他各个电针组在相应时间段内，施以同等条件抓取，但不实施任何针刺干预。

2.5 实验指标：所有实验动物在构建MACO 模型成功治疗5 d后再次行神经功能学评分，随后快速断头取脑，行TTC 染色观察脑梗死体积，取海马及纹状体组织分别行免疫组化染色检测Bax、Bcl-2 的表达，RT-PCR检测PI3K1、AKT 基因含量和表达情况，具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行。

3 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件。数值变量以平均值±标准差表示，分类变量以范围和中位数(Range，Median)表示；数值变量方差齐性资料采用单因素方差分析(两两比较采用SNK 检验)，方差非齐性资料采用秩和检验；分类变量进行卡方检验；均为双侧检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 电针对MCAO 模型大鼠神经功能缺损的影响 见表1。假手术组评分为0，未见脑缺血再灌注神经功能损坏表现。MCAO模型组神经功能评分明显高于假手术组，说明局部脑组织缺血后造成了明显的神经功能障碍。脑缺血1.5 h 再灌注后6 h 和12 h组电针处理后，神经功能评分明显低于MCAO组(P<0.05)，提示电针治疗能够改善局灶性缺血再灌注损伤后的神经功能。而1 h、24 h、48 h 电针治疗组动物神经功能缺损评分与MCAO 组差异无统计学意义(P>0.05)，提示过早或过晚进行电针治疗干预均不能改善局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经功能。

2 各组大鼠脑梗死体积比较 见表1。与MCAO 组相比，6 h、12 h 电针治疗组右侧脑梗死体积比明显减小(P<0.05)，1 h、24 h、48 h 电针治疗组右侧脑梗死体积比改变差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同时间电针治疗对大鼠MCAO 模型神经功能缺损及脑梗死体积百分比的影响

注：与假手术组组相比，#P<0.05；与MCAO相比，*P<0.05

3 大鼠纹状体区域Bax、Bcl-2 的蛋白表达 如图1，图2所示，大鼠纹状体区域假手术组(Sham 组)bcl-2、bax 表达阴性，各组非缺血侧未见明显染色。如表2所示，与假手术组(Sham 组)比较，MCAO 组纹状体组织Bax 的表达明显升高(P<0.01)。与MCAO 组比较，6 h 电针治疗组纹状体组织Bax 表达显著降低(P<0.01)，1 h 电针治疗组、12 h 电针治疗组、24 h 电针治疗组、48 h 电针治疗组纹状体组织Bax 表达与MCAO 组比较明显降低(P<0.05)。与假手术组(Sham 组)比较，MCAO 组纹状体区域Bcl-2 表达差异无统计学意义(P>0.05)。与MCAO 组比较，6 h 电针治疗组纹状体区域Bcl-2 表达显著降低(P<0.01)，1 h 电针治疗组、12 h 电针治疗组、24 h 电针治疗组、48 h 电针治疗组纹状体区域Bcl-2 表达与MCAO 组比较明显降低(P<0.05)。

表2 大鼠纹状体区域Bax、Bcl-2的OD值

注：与假手术组组相比，#P<0.05；与MCAO相比，*P<0.05

4 针刺对MCAO 模型大鼠脑组织AKT-1、PI3K 的影响 见表3。

表3 不同介入时间电针治疗对纹状体AKT-1/PI3KmRNA 相对表达量的影响

注：与假手术组组相比，#P<0.05；与MCAO相比，*P<0.05

图1 纹状体区域Bax 的表达(免疫组化染色×400)

图2 纹状体区域Bcl-2 的表达(免疫组化染色×400)

MCAO 模型纹状体组织AKT-1 mRNA表达与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)；与MCAO 组比较，6 h 电针治疗组AKT-1mRNA 表达显著增加(P<0.01)；1 h 电针治疗组、12 h 电针治疗组、24 h 电针治疗组、48 h 电针治疗组mRNA 表达明显增加(P<0.05)(表3)。假手术组脑组织中少量PI3K mRNA 表达； MCAO 模型纹状体组织PI3K mRNA 表达与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)；与MCAO 组比较，1 h 电针治疗组、6 h电针治疗组AKT-1 mRNA 表达明显增加(P<0.05)；12 h 电针治疗组、24 h 电针治疗组、48 h 电针治疗组mRNA 表达无明显增加(P>0.05)。

讨 论

目前作为将传统的针灸治疗与现代的电极刺激结合的产物，电针可通过肌肉组织和神经组织的电刺激达到治疗脑梗塞的目的以及提高脑梗塞患者的生活质量[8]。在亚洲国家中，针灸已经被广泛应用在神经系统疾病当中，而针灸因为其特殊的疗效已经越来越被西方国家所重视。尽管针灸在临床应用的实验室依据还待有效的数据进一步来证明，但在过去的十年期间人们在针灸的临床应用中所积累的各种评价和现有的数据的表明：其在一些神经系统疾病中，如面神经炎、脊髓损伤、三叉神经痛的治疗效果是显著的。这些针灸治疗的临床研究可以通过PubMed和个人文件中检索获得，并通过美国预防服务工作组对其进行评价总结[9]，而对于电针治疗脑梗塞的临床疗效已经得到了很多学者的认可，电针刺激百会穴可以有效地降低脑卒中后的脑萎缩的发生率[10]。电针可以使大脑的局部血流增加[11]。而且大量临床循证医学支持急性期的治疗优于恢复期和后遗症期[12]，但有些学者认为并非越早给予治疗就越好[13]。所以我们推测可能存在一个脑梗塞的最佳治疗时间窗，而这个时间窗尚需我们进一步探索。

Bcl-2蛋白家族主要参与细胞的内源性凋亡途径完成对细胞凋亡的调控。研究发现B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)基因家族在神经元死亡中起着重要的作用，主要通过调节线粒体外细胞膜的通透性，来参与神经元的内在细胞凋亡途径[14]，Bcl-2基因家族主要由促进细胞凋亡蛋白(包括BaK，Bax等)、抗细胞凋亡蛋白(包括Bcl-2，Bcl-xl和Bcl-w等)、和BH3-only蛋白(包括Bid、Bak、Puma等)组成。目前研究证实的抑制凋亡基因有Bcl-2、Bcl-xl等，而促进凋亡基因的有Bax、Bak等。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族参与了细胞的凋亡以及存活等主要功能，其能通过活化产生的第二信使—3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]，进而进一步的活化。哺乳动物细胞中，PI3K分为I、II及III型，其中I型可以通过结合酪氨酸激酶连接受体和G蛋白连接受体，进而传递下游信号，在外部刺激的作用下，产生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PIP3)，PIP3与细胞内的的信号蛋白Akt和PDK1结合，进而使Akt被PDK1磷酸化而活化。正常情况下，PI3K/AKT信号通路在诱导凋亡的过程中，主要的功能是磷酸化下游蛋白而实现细胞存活，这种作用大于诱导凋亡的作用，甚至可以通过某些途径实现抑制凋亡诱导蛋白的作用[15]。

本文通过研究不同介入时间的电针治疗对大鼠MCAO模型局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，探索电针治疗的最佳介入治疗时间窗，以及探索其发挥神经保护作用的可能机制。本研究结果提示电针可增强AKT-1和PI3K的表达，从而激活PI3K/AKT信号转导通路信号通路，发挥神经保护作用。因此，本研究选择了PI3K和AKT-1作为凋亡指标，通过研究我们发现再灌注后6 h进行电针治疗对脑缺血再灌注损伤治疗的效果比较好。结果提示电针可增强AKT-1和PI3K的表达，从而激活PI3K/AKT信号转导通路信号通路，发挥神经保护作用。上述结果均进一步证实大鼠MCAO模型局灶脑缺血再灌注后6 h是电针治疗的较好时机。

综上所述，本实验的结果提示，电针治疗能够很好的改善大鼠脑缺血再灌注损伤，缺血1.5h后再灌注后6h是电针介入治疗的较好时机。电针治疗可以增强Bcl-2、AKT-1和PI3K的表达，降低Bax的表达，来抑制细胞凋亡并激活PI3K/AKT信号转导通路信号通路，而发挥神经保护作用。

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