苦参消癥汤对宫颈癌大鼠模型癌组织中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达的干预作用*

赵亚丽,王 聪

河南省职工医院妇产科(郑州 450000)

宫颈癌为女性生殖器官的三大癌症之一，也是妇科上一种十分常见的恶性肿瘤。宫颈部发生上皮内瘤变后逐渐进展而侵袭至上皮的下基膜间质最终形成宫颈癌[1-2]。宫颈的转化区域上皮化生活动度过高，并且受到癌细胞激活因素的刺激亦可形成本病[3]。宫颈癌的发生多与患者的早婚、分娩次数、性生活习惯、高危型的HPV病毒感染等因素相关。本病及早期少数患者可见有阴道内接触性出血、阴道分泌物异常等表现，但多数患者并无明显的临床表现，至晚期时方发生阴道不规则出血及因癌组织浸润其他组织器官而发生的继发症状。近些年来，我国宫颈癌的发生率呈现出上升趋势，发病年龄表现出年轻化的趋势[4-6]。苦参的主要有效成分苦参碱具有降低肿瘤细胞凋亡抑制因子表达，升高肿瘤细胞凋亡因子表达的明确作用，能够促使癌细胞的凋亡，抑制恶性肿瘤细胞的增殖与生长。为了明确以苦参为主的自拟中药方剂苦参消癥汤对于宫颈癌的治疗作用，本院开展本次动物模型研究，以为本院自拟苦参消癥汤的临床应用提供数据参考。

材料与方法

1 实验材料 自中国科学院上海动物中心购进Wistar雌性大鼠60只，年龄6周，体重为141～159 g。自中国医学科学院基础研究所购进人宫颈癌Hela细胞株；自Cell Signalling Technology公司购进兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人Caspase-7、兔抗人Survivin抗体，DAB显色剂；自同仁堂中药饮片公司购进自拟苦参消癥汤药物，方剂组成为：苦参、生黄芪各30 g，赤芍24 g，七叶一枝花、白花蛇舌草、蒲公英、紫花地丁、野菊花、山萸肉各15 g，猪苓12 g，乳香、没药、泽泻、炙甘草各10 g。

2 宫颈癌动物模型建立 于无菌条件下，将人宫颈癌Hela细胞株放入培养皿中，于培养皿中加入由10%胎牛血清与2%谷氨酰胺配制的RPMI-1640培养液当中；置于37 ℃、5%体积分数的CO2饱和湿度条件下培养24 h，以体积分数10%的小牛血清、0.25%的胰酶消化细胞培养基终止；按1200r/min速度离心10 min，后洗涤，将细胞计数调整为107/ml，取得人宫颈癌Hela细胞的悬液0.5 ml，于大鼠的腋窝处皮下注射；常规饲养7 d后，可见肿瘤结节为宫颈癌动物模型造模成功。

3 分组与治疗方法 购买的60只大鼠随机选取10只纳入空白组，其余50只大鼠建立宫颈癌模型；建模成功的共计47只，死亡1只，自建模成功的46只大鼠中选取30只随机均分后，分别纳入模型组、阳性对照组以及观察组，每组均为10只。空白组持续常规喂养，自由食水；模型组造模后不予任何治疗与空白组相同方法喂养；观察组给予自拟苦参消癥汤治疗，将上述苦参消癥汤方剂以500 ml水煎至200 ml，给药剂量按人鼠比20∶1，40 ml/d灌胃；阳性对照组给予安慰剂纯净水，剂量与观察组相同灌胃；各组均维持8周。

4 观察方法 治疗8周后处死各组大鼠，观察除空白组以外各组大鼠宫颈癌病灶的大小。测定空白组皮下组织及建模各组癌组织中的Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达水平，宫颈癌动物模型各组均取癌组织50 mg，空白组取腋窝皮下组织50 mg；将取得的组织以PBS缓冲液充分洗涤，之后进行研磨及离心收集，以冰冷 PBS液洗涤细胞3次，滴加裂解缓冲液，充分混匀，于4 ℃的水中水浴30 min后，按1200r/min的速度离心10 min，取得胞质蛋白上清液。以BCA法测定胞质蛋白含量。将上述胞质蛋白液定溶为30～40 μg，以SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质转移至PVDF膜。使用PBST洗膜5 min，以PBST溶解并封闭PVDF膜2 h。滴加1∶1000比例稀释后的兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人Caspase-7抗体、兔抗人 Survivin抗体，于4 ℃环境中静置12 h。以PBST洗涤10 min/次，共3次；加入二抗，置于温室中孵育2 h，再以PBST洗涤10 min/次，共3次。PVDF膜以ECL显色，于暗室中行PVDF的X线曝光，以凝胶成像系统分析读取结果。分析癌症病灶体积与Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达水平间的相关性。

5 统计学方法 使用SPSS 20.0统计学软件分析本次研究数据，各组间数据差异性以单因素ANOVA分析，进一步两两对比采用LSD-L分析，相关性分析采取Pearson相关性分析；校验水平均为α=0.05，差异有统计学意义标准均为P<0.05；具有统计学相关性标准为|r|>0.3，低度相关性为0.3≤|r|<0.5，中度相关性为0.5≤|r|<0.8，高度相关性为|r|≥0.8。

结 果

1 宫颈癌病灶体积 见表1。各组间宫颈癌病灶体积对比具有差异性(P<0.05)；进一步两两对比模型组与阳性对照组宫颈癌病灶体积无统计学差异(P>0.05)；观察组与模型组、阳性对照组间对比均有统计学差异(P<0.05)。

表1 四组癌病灶体积对比

注：与模型组对比，☆P<0.05;与阳性对照组对比,★P<0.05

2 Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达水平 见表2。各组间癌组织中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表达水平具有差异性(P<0.05)；进一步两两分析，空白组与各组间均具有差异性、观察组与各组间均具有差异性(P<0.05)，模型组与阳性对照组间无差异性(P>0.05)。

表2 各组

注：与空白组对比,◆P<0.05;与模型组对比,☆P<0.05;与阳性对照组对比,★P<0.05

3 相关性分析 见表3。宫颈癌肿瘤病灶体积与Caspase-3、Caspase-7间均具有高度负相关性，与Survivin间均具有高度正相关性(|r|>0.8，P<0.05)。

表3 癌肿体积与Caspase-3、Caspase-7、Survivin相关性分析统计值

讨 论

宫颈癌是威胁女性身体与生命安全的一项常见恶性肿瘤，宫颈癌是由宫颈的上皮内瘤变发展形成的生殖系统癌性病变[7-9]。本病早期行手术治疗可获得理想的疗效，但仍可对患者预后生活造成一定程度的影响。病情发展至晚期时则丧失手术治疗时机。随着新辅助化疗的推广为中晚期宫颈癌患者提供新的治疗手段，化疗药物直接作用于瘤体可取得较好疗效[10-11]。宫颈癌的形成与演进与肿瘤细胞的异常增殖、凋亡减少具有直接关系。凋亡细胞主要作用是诱导肿瘤细胞凋亡，促使新细胞形成取代凋亡的细胞，使细胞的凋亡与增殖维持在相对平衡状态下。如凋亡细胞有所减少，和(或)凋亡抑制因子的表达异常，则使这种相对平衡的关系被破坏，导致肿瘤出现大量无限制异常增殖与生长，随着时间的延长肿瘤病灶逐渐扩大，并向外、向纵深浸润，累及周围组织或器官，侵袭至淋巴组织后逐渐向远端扩散。由这一发展过程可知，下调癌肿组织当中凋亡抑制因子的水平并升高促进凋亡因子的水平，是恢复凋亡、增殖平衡机制的最直接手段。

Survivin是目前已知最强效的抑制凋亡因子。可抑制肿瘤细胞的凋亡，激活因子酶原的活性而发挥抑制癌肿细胞凋亡的作用。健康人体中Survivin几乎不表达，但在恶性肿瘤组织中可见异常高表达。在宫颈上皮内瘤变组织中Survivin可见中度表达，而宫颈癌组织当中Survivin则出现显著高表达。因此Survivin可作为宫颈癌及其他恶性肿瘤诊断及评估的重要指标。Caspase-3与Caspase-7均为促进细胞凋亡因子Caspase系列的组成部分，能够诱导肿瘤细胞的凋亡[12-14]。人体中的多数细胞凋亡过程均依赖于凋亡因子的诱导，凋亡促进因子的表达被抑制时，其活性减低抑制作用下降，导致肿瘤细胞的凋亡大幅下降，增殖与凋亡间的平衡机制紊乱，致使癌肿形成。Survivin下降，Caspase-3与Caspase-7上升时，可使恶性肿瘤细胞的异常过度增殖被完全或部分阻断，从而使癌肿瘤病灶停止或延缓生长，因此具有控制甚至是缩小癌肿体积的作用。

中医理论认为肿瘤属于“癥瘕痞块”，宫颈癌属于“带下”病范畴。中医认为本病的治疗应以清热解毒、消瘕化癥、软坚散瘀为原则。苦参是中医治疗宫颈癌的常用药物，近些年来苦参提取物亦多应用于宫颈癌化疗辅助治疗当中[15]。本院根据中医治疗原则结果临床治疗经验拟定出苦参消癥汤治疗本病。方中苦参含有的苦参总碱有显著的升高白细胞作用，苦参对多种细菌有较强的抑制作用，苦参具有抗肿瘤作用。生黄芪可补益卫气、固表止汗，具有利水消肿、托疮生肌的功效；七叶一枝花有抗癌败毒，治疗痈疽、无名肿毒之功效且疗效显著。白花蛇舌草性寒而味甘，清凉而解热，任何癌肿均可选其入药治疗。赤芍药性微寒、味苦，归肝经；有活血祛瘀、清除败血、溶解血栓、清热凉血之功效。蒲公英具有消痈散结、清热解毒、凉血消炎之功效、可治疗恶疮、痈肿疔毒等症。地丁主要功效为清热凉血、泻热解毒，其主要特点是不伤脾胃。野菊花性微寒、味苦、辛，归肝、肺经；具有清热解毒之效，可用于疔毒、痈肿。泽泻泄热浊、渗湿、利腐水，可治疗水肿胀满、小便不利。猪苓性平淡、味甘，功效为利水渗湿，主治由湿气下注、郁遏下焦、膀胱气化失司引起的肌肤浮肿、排尿困难。乳香、没药具有理气活血,止痛去痛,杀毒追毒功效，主治气血痹阻、痈肿疮毒、瘀血刺痛。山萸肉药性微温、味涩，归肝、肾经；其功效为补肝益肾、涩精止带、固脱止崩、止渴生津、收敛止汗，另外山萸肉有抗菌抑菌功效，通过其扶正气作用来补益机体的诸多不足。炙甘草培补中气、调和诸药；现代药理学认为甘草有类激素作用和抗应激作用。

本次研究结果表明，观察组癌肿体积小于模型组与阳性对照组，证明了苦参消癥汤具有抑制和(或)缩小癌种体积的明确作用。观察组Caspase-3、Caspase-7低于空白组，但高于模型组与阳性对照组；观察组Survivin高于空白组，但低于模型组与阳性对照组；而模型组与阳性对照组间并无差异。说明安慰剂对于宫颈癌组织中Caspase-3、Caspase-7、Survivin并无干预作用，但苦参消癥汤则可明确升高Caspase-3、Caspase-7表达，降低Survivin，对于恢复细胞增殖、凋亡的平衡具有明确作用。但8周灌胃后，观察组Caspase-3、Caspase-7、Survivin与空白组仍有差异，提示本方在8周内无法达到完全治愈宫颈癌的治疗效果。同时通过相关性可知，Caspase-3、Caspase-7、Survivin与宫颈癌肿瘤体积具有明确的相关性，随着癌肿体积的增大Caspase-3、Caspase-7在癌肿组织中的表达水平明显下降，而Survivin的表达水平显著上升。

综上所述，本院自拟苦参消癥汤对于宫颈癌大鼠模型具有明确缩小或抑制癌肿生长的作用，能够明确的下调Survivin在癌组织中的表达，上调Caspase-3、Caspase-7的表达，促进细胞增殖与凋亡机制的恢复，对于宫颈癌具有明确治疗作用，但短期内无法达到临床治愈的疗效。

[1] 董云虹.p16蛋白、细胞分化抑制因子-1(Id-1)、Cav3.1、Cav3.2、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216在宫颈癌组织中的表达及其意义[J].陕西医学杂志,2017,46(4):492-493.

[2] Meng K,Yuan M,Xu S,etal. Human cervical cancer oncogene-1 over expression in colon cancer and its clinical significance[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(1):939-943.

[3] Kumakech E,Andersson S,Wabinga H,etal.Integration of HIV and cervical cancer screening perceptions and preferences of communities in Uganda[J].BMC Womens Health,2015,15(1):183.

[4] 陈红虹.宫颈癌筛查应用多重核酸扩增荧光检测技术的效果观察[J].辽宁医学杂志,2015,29(6):346-347.

[5] Robb SW,Benson K,Middleton L,etal. Mindfulness-based stress reduction teachers,practice characteristics,cancer incidence,and health:a nationwide ecological description[J].BMC Complement Altern Med,2015,15(1):545.

[6] Cooper D,Mantell JE,Moodley J,etal.The HIV epidemic and sexual and reproductive health policy integration:views of South African policymakers[J].BMC Public Health,2015,15(1): 1577.

[7] Abliz G,Mijit F,Hua L,etal. Anti-carcinogenic effects of the phenolic-rich extract from abnormal Savda Munziq in association with its cytotoxicity,apoptosis-inducing properties and telomerase activity in human cervical cancer cells(Si Ha)[J].BMC Complement Altern Med,2015,15(1):530.

[8] Hao Z,Yang J,Wang C,etal.Micro RNA-7 inhibits metastasis and invasion through targeting focal adhesion kinase in cervical cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(1): 480-487.

[9] Russomano F,Tristao MA,Cortes R,etal.A comparison between type 3 excision of the transformation zone by straight wire excision of the transformation zone(SWETZ)and large loop excision of the transformation zone(LLETZ):a randomized study[J].BMC Womens Health,2015,15(1):174.

[10] Arville B,DS Al,Mehrotra S.Cervical squamous cell car-cinoma metastatic to pericardial fluid-large cell balls mas-querade as adenocarcinoma[J].Diagnostic Cytopathology,2015,43(11):912-915.

[11] Sood S,Patel F,Ghosh S,etal.Epigenetic alteration byDNA methylation of ESR1,MYOD1and hTERT genepromoters is useful for prediction of response in patientsof locally advanced invasive cervical carcinoma treated bychemoradiation[J].Clin Oncol(R Coll Radiol),2015,27(12):720-727.

[12] Chen CC, Wang L, Lin JC,etal. The prognostic factors for locally advanced cervical cancer patients treated by intensity-modulated radiation therapy with concurrent chemotherapy[J].J Formos Med Assoc,2015,114(3):231-237.

[13] Huang H, Xu S, Li F,etal. Computed tomography-guided (125)I seed interstitial implantation for head and neck cancer patients with unmanageable cervical lymph node metastases [J].World J Surg Oncol,2015,13(1):443.

[14] 罗利民,赵 展,贾勇士,等.顺铂与奈达铂同步放化疗对中晚期宫颈癌的实效性对照探究[J].中华全科医学,2016,14(3):365-367.

[15] 任 莉,田晓予.复方苦参注射液联合新辅助化疗对宫颈癌疗效及生存期的影响[J].陕西中医,2017,38(5):616-618.