大豆转录因子GmWRKY58 亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析

张红梅，刘晓庆，陈华涛，袁星星，崔晓艳，张智民，黄中文，陈 新

(1.江苏省农业科学院 经济作物研究所，江苏 南京 210014；2.河南科技学院 农学系，河南 新乡 453003)

干旱、高盐、低温、高温等极端条件，是植物生长过程中所面临的主要逆境胁迫因子。在逆境条件下，与植物抗逆相关基因被诱导表达，从而产生胁迫响应。植物响应非生物胁迫的基因可分为两类：①功能基因，如编码与胁迫有关的LEA蛋白、抗冻蛋白、渗透调节因子合成酶以及逆境胁迫产生的ROS等清除系统的相关酶基因[1]；②编码与抗逆相关参与信号传递蛋白激酶和调控基因表达的转录因子，如MYB、bZIP、WRKY、AP2/EREBP和NAC等[2]。WRKY转录因子是植物中发现最早的一类转录调控因子，根据WRKY结构域的数目和锌指纹结构的类型，WRKY蛋白可分成3组[3]：第Ⅰ组含2个WRKY结构域，锌指纹结构模式为C-X4-5-C-X22-23H-X-H，如SPF1、ABF1、PcWRKY1和AtWRKY33[4-7]等；第Ⅱ和Ⅲ组均含1个WRKY 结构域，第Ⅱ组锌指纹结构模式与第Ⅰ组相同，如AtWRKY18(NP_567882)等；第Ⅲ组仅在组成锌指纹的氨基酸有变化，为C-X7-C-X22-23-H-X-C，如AtWRKY70(NP_191199)等。

Ishiguro 和Nakamura[4]在甘薯中发现了第一个WRKY转录因子SPF1。随后，其他研究者又相继在水稻、拟南芥、棉花、烟草、大麦、小麦和豆类[8-14]等植物中克隆得到WRKY转录基因。WRKY转录因子不仅参与植物抗病与非生物胁迫的响应，而且在植物生长发育、次生代谢等过程中起重要作用[15-20]。拟南芥AtWRKY22和AtWRKY29是MAPK通路中重要的下游组成成分[21]，对拟南芥抵抗真菌和细菌等抗性具有调节作用。李立芹[22]研究发现，烟草WRKY12基因受4 ℃低温胁迫诱导表达。在拟南芥中过表达AtWRKY25和AtWRKY33 基因，能够显著增强转基因植株对高温和高盐的耐受性[23-25]；过表达OsWRKY47能提高水稻的抗旱性[26]。拟南芥AtWRKY28基因受ABA、高盐、机械损伤和低磷胁迫诱导表达[27-28]。大豆基因组中大约有300个WRKY基因(http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Gma)，但目前仅有少数第Ⅱ组成员的功能被鉴定，如GmWRKY111[29]、GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54[15]参与盐、干旱和冷害等多种非生物逆境胁迫的应答反应，它们过量表达，能增强植物对盐、干旱和冷害的适应性。

大豆(Glycinemax)是我国最重要的油料作物之一，干旱、盐害、低温和低磷等非生物胁迫严重影响大豆的产量和品质。已有研究表明，大豆很多WRKY参与非生物胁迫的转录调控，然而关于WRKY Group Ⅲ成员参与非生物胁迫响应及功能分析的研究较少。Yang等[30]研究发现，大豆WRKY家族第Ⅲ组的GmWRKY58和GmWRKY76在大豆发育过程中具有重要作用。过量表达GmWRKY58和GmWRKY76基因的拟南芥比野生植株开花早，这种提早开花的表型与几个促进开花基因的表达增加有关；病毒诱导大豆GmWRKY58和GmWRKY76基因沉默导致植物叶片扩展减少和茎生长停止等不良现象，但GmWRKY58在响应非生物逆境胁迫的表达模式还未见报道。本研究采用荧光定量方法，分析不同非生物逆境胁迫下GmWRKY58基因的表达水平，明确其响应的非生物逆境胁迫因子，为进一步探究GmWRKY58基因在非生物胁迫应答中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

本研究所用大豆材料为科丰1号，由江苏省农业科学院豆类作物研究室提供。采用改良的Zhang等[31]的方法于2015年6月大豆长到两叶一心时，取整齐度一致的幼苗放置在1/2 Hoagland营养液中生长2 d，换至正常营养液中生长，营养液pH调至6.0。2 d以后将大豆幼苗分别于含200 mmol/L NaCl 和2% PEG8000的Hoagland 营养液中进行高盐、干旱胁迫处理，分别在0，6，12，24，48 h取根、茎、叶样；于4 ℃培养箱进行低温处理，用2 mmol/L水杨酸(SA)喷施，分别取0，6，9，12，24，48 h叶片样；低N(75.8 mmol/L)、低P(5 μmol/L)、低K(96.5 mmol/L)和缺Fe(0 mmol/L)处理0，6，12，24，48 h取根、叶样，对照组分别采用正常营养液。

挑选籽粒饱满、大小一致的科丰1号种子种植于土壤中，待真叶自然展开后，于2015年5月19日取根、茎、叶，2015年6月19日取花，2015年7月3日取幼荚，2015年8月8日取幼嫩种子。每处理3 次重复。将样品迅速置于液氮中，-80 ℃保存备用。

1.2 大豆总RNA 提取与cDNA合成

采用RNA提取试剂盒(RNA plant plus Reagent，TIANGEN)提取大豆不同组织、不同处理时间点样品的总RNA，按照反转录试剂盒(M-MLV reverse transcriptase，TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链[32]。

1.3 基因克隆

从Phytozome(http：//www.phytozome.net/)网站下载大豆GmWRKY58 核酸序列，采用Premier 5 设计特异引物，上游引物为GmWRKY58 F：5′-ATGA

GTATTCTCTTCCCAAGAAG-3′，下游引物为GmWRKY58 R：5′-CTAAAGCAATTGGCTTTCATC-3′。

以大豆cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。25 μL的PCR反应体系中包括10×Taq缓冲液3.0 μL，Taq聚合酶0.5 μL，2.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L) 2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物各1 μL (10 pmol/L)，最后用ddH2O补至25 μL。PCR 产物电泳后，切胶纯化回收。回收片段与pGEM-T easy载体连接，连接产物进行热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。经鉴定后的阳性克隆送Invitrogen公司测序。

1.4 生物信息学分析

使用在线软件Compute pI/Mwtool、ExPASy (http：//expasy.org/tools/pi_tool.html)预测蛋白的分子量和等电点；通过SignalP (http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析GmWRKY58蛋白质的信号肽；由DNAMAN软件完成多序列比对；以MEGA 6 软件构建进化树；选取GmWRKY58 基因ATG上游1.5 kb的碱基序列，在 PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站预测顺式作用元件。http：//www.genscript.com/wolf-psort.html进行亚细胞定位分析。二级结构预测使用http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/完成。

1.5 实时荧光定量(qRT-PCR)分析

以单链cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物：F：5′-CATGCATGGAGAAAGTACGG-3′；5′-GTTG

CACTTGTTTGGTTGCT-3′。以大豆组成型表达β-Tubuin基因(GenBank 登录号为AK286413)为内参基因(F：5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′；R：5′-C

ACTTACGCATCACATAGCA-3′)。采用ABI PRISM7500实时荧光定量系统进行基因表达分析。反应体系为：模板cDNA 1.0 μL(10 ng/μL)，2×SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)10.0 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1.0 μL，Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL，补ddH2O至20.0 μL。反应程序为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40个循环。采用2-ΔΔCT[33]法分析数据，计算GmWRKY58基因相对表达量。每个取样点设3次生物学重复，qRT-PCR为3次技术重复。

1.6 亚细胞定位

以GmWRKY58基因的ORF正确的克隆提取质粒，经NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，同时pCambia1302质粒用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，分别回收小片段和大片段，将二者用T4-DNA连接酶进行连接，从而得到35S∷GmWRKY58∷GFP融合表达载体，转入DH5α大肠杆菌。用菌落PCR、酶切方法筛选阳性克隆，并测序验证。

获得的重组质粒35S∷GmWRKY58∷GFP转入TOP10克隆菌株。参照文献[34]，在3.0 mL LB液体培养基(含50 mg/LKam，17 mg/LRif )中培养含双元载体的农杆菌，28 ℃，200 r/min 过夜培养，室温下3 000 r/min离心10 min后收集菌体，加1.0 mL注射培养基悬浮菌体，室温3 000 r/min离心10 min后弃上清，重复一次，最后用注射培养基悬浮。测600 nm吸光值(OD)，当农杆菌菌液浓度(OD600)为0.1～0.2时，用无针头的注射器将农杆菌菌液注射到3～4周龄的本氏烟叶片。然后在温室中培养(27 ℃光照16 h，22 ℃黑暗8 h) 24～72 h，在激光扫描电镜下观察荧光蛋白的发光情况。

2 结果与分析

2.1 GmWRKY58 克隆及序列分析

从Phytozome(http：//www.phytozome.net/)网站下载大豆GmWRKY58 核酸序列，根据CDS序列设计引物，以科丰1号大豆叶片cDNA为模板进行PCR，扩增出单一的条带。将测序得到的结果与大豆基因组数据库(http：//www.phytozome.net/)进行序列比对，结果显示与大豆Williams 82.a2.v1的Glyma.04G223300(NP_001237638)基因序列完全一致 (图1)。目的片段大小为954个核苷酸，具有一个完整的开放阅读框。序列分析发现，氨基酸序列N端具有WRKYGQK的保守结构域，C端具有C-X7-C-X22-23-H-X-C保守结构域(图1)，系WRKY家族基因GroupⅢ成员。

方框为WRKY结构域和锌指蛋白结构域。Boxes stands for the WRKY domain and zinc finger protein domain，respectively.

2.2 氨基酸序列及理化性质分析

GmWRKY58基因编码一个含有317个氨基酸，分子量为35.855 6 ku蛋白质，等电点为5.46。GmWRKY58为稳定在组织中的表达特性蛋白，无信号肽。GmWRKY58编码蛋白的整条肽链都位于细胞核。二级结构预测结果表明，在GmWRKY58蛋白中，螺旋结构占60.60%，肽链占59.0%，无规则卷曲占17.7%。

为了研究GmWRKY58的进化情况，笔者构建了GmWRKY58的系统进化树(图2)。结果显示：GmWRKY58与大豆WRKY70(XP_003526799)序列一致性最高，为91%；其次为绿豆WRKY70(XP_014500012)、鹰嘴豆WRKY70(XP_004502820)、巨桉WRKY70 (XP_010067621)、毛果杨WRKY70 (XP_002319879)、胡杨WRKY70 (XP_011014496)、苹果WRKY70 (XP_008369379)、麻风树WRKY70 (XP_012091128)和可可WRKY70 (XP_007011367)，序列一致性为43%～74%；而与野草莓亚种WRKY70(XP_004305079)、桑树WRKY70(XP_010093537)、甜瓜WRKY70(XP_008442314)、烟草WRKY70(XP_009586653)和芝麻WRKY70(XP_011085118)的一致性较低。

Pe.胡杨；Pt.毛果杨；Jc.麻疯树；Tc.可可；Gr.雷蒙德氏棉；Vv.葡萄；Eg.巨桉；Ca.鹰嘴豆；Vr.绿豆；Gm.大豆；Md.苹果；Nn.莲；Fv.野草莓亚种；Mn.桑树；Cm.甜瓜；Nt.烟草；Si.芝麻。

PeWRKY70.Populuseuphratica，XP_011014496；PtWRKY70.Populustrichocarpa，XP_002319879；JcWRKY70.Jatrophacurcas，XP_012091128；TcWRKY70.Theobromacacao，XP_007011367；GrWRKY70.Gossypiumraimondii，XP_012460911；VvWRKY70.Vitisvinifera，XP_002275401；EgWRKY70.Eucalyptusgrandis，XP_010067621；CaWRKY70.Cicerarietinum，XP_004502820；VrWRKY70.Vignaradiatavar.，XP_014500012；GmWRKY70.Glycinemax，XP_003526799；MdWRKY70.Malusdomestica，XP_008369379；NnWRKY70.Nelumbonucifera，XP_010252044；FvWRKY70.Fragariavescasubsp.，XP_004305079；MnWRKY70.Morusnotabilis，XP_010093537；CmWRKY70.Cucumismelo，XP_008442314；NtWRKY70.Nicotianatomentosiformis，XP_009586653；SiWRKY70.Sesamumindicum，XP_011085118.

图2大豆GmWRKY58与其他植物WRKY蛋白的系统演化分析
Fig.2PhylogeneticanalysisofthededucedaminoacidsequencebetweenGmWRKY58andotherWRKYproteins

2.3 组织表达特性

GmWRKY58基因在根、茎、叶和花等器官中均有表达，在不同器官基因表达水平从高到低的顺序依次为：叶、根、茎、花、荚，在营养器官根、茎、叶中的表达量显著高于花和荚生殖器官中的表达量(图3)。其中，叶片中的表达量为根的2.16倍；在根和茎中的表达量相差不大，花和荚中的表达量较低。这可能是由于植物根茎叶在感知逆境信号和激素信号中起重要作用。

2.4 GmWRKY58 在非生物胁迫下的表达特性

用高盐、干旱、低温、SA、低N、低P、低K和缺Fe处理大豆幼苗，以qRT-PCR分析其表达动态(图4-6)。

结果表明，高盐胁迫能强烈诱导GmWRKY58表达，200 mmol/L的NaCl处理下(图4-A)，GmWRKY58基因在根和茎中的表达呈先升高后下降的变化趋势，根和茎中上调表达至最高值分别出现在12，24 h，为相对表达量为0 h时的187.4，13.1倍；

不同小写字母表示在新复极差法分析中0.05水平上存在显著性差异。图4-6同。Bars superscripted by different lowercase letters are significantlydifferent at the 0.05 probability level.The same as Fig.4-6.

叶中表达呈下降趋势，在叶中的表达量则始终低于对照。2% PEG8000干旱处理后，在根、茎和叶中的诱导表达模式不尽相同，根中GmWRKY58表达量高于茎和叶。根和茎中最高表达量均出现在处理后48 h，分别是0 h时的15.1，18.4倍，表现为先升后降再升的趋势和上升趋势；叶中总体表现为先升后降的趋势，最高表达量出现在处理后12 h，是0 h时的10.0倍(图4-B)。低温(4 ℃)和水杨酸(SA)处理(图5)没有明显的上调或下调表达趋势，上调表达至最高值分别出现在处理后12 h 和24 h，相对表达量为0 h时的2.7，1.7倍。

低N、低P、低K和缺Fe处理后，GmWRKY58诱导表达模式存在差异。低N和缺Fe处理后，GmWRKY58基因在根中相对表达量高于叶片，最高表达量分别出现在处理后24，6 h，是0 h时的4.9，3.4倍(图6-A、D)。低P和低K处理后，GmWRKY58在叶中的相对表达量高于根，最高表达量均出现在叶中0 h，表现为先降后升的趋势(图6-B、C)。

图4 盐胁迫(A)和干旱(B)处理条件下GmWRKY58基因的表达Fig.4 Expression of GmWRKY58 under salt stress (A) and drought (B) treatments

图5 低温4 ℃(A)和SA(B)诱导大豆叶片GmWRKY58表达 Fig.5 Expression of GmWRKY58 in leaf of soybean induced by cold (4 ℃，A) and SA (B) treatments

2.5 GmWRKY58 蛋白的亚细胞定位

通过PSORTII(http://www.genscript.com/wolf-psort.html) 网站对GmWRKY58蛋白进行亚细胞定位预测，结果定位于细胞核中。为了从试验上进一步证明其亚细胞定位，将瞬时表达载体35S∷GmWRKY58∷GFP转化到本氏烟叶片，温室培养24～72 h后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号。结果显示(图7)，转pCambia1302-GFP 载体的绿色荧光分布在整个细胞膜、细胞核和细胞质中，转35S∷GmWRKY58∷GFP载体的绿色荧光分布在细胞核中，说明GmWRKY58定位在细胞核中，这与GmWRKY58基因序列上含有一个核定位信号(NLS)区域的特征相符，也与生物信息学预测结果相同，说明GmWRKY58是转录因子，定位在细胞核内调控下游相关基因的表达。

图6 低N(A)、低P(B)、低K(C)和缺Fe(D)诱导GmWRKY58表达 Fig.6 Expression of GmWRKY58 in soybean induce by low nitrogen (A)，low phosphorus (B)，low potassium (C) and iron deficiency (D) treatments

A、D.紫外激发的荧光信号；B、E.可见光的信号；C、 F. A和B叠加，D和E叠加。 A，D.UV-excited fluorescence signals；B，E.Signals under bright field；C，F.Merged image of A and B,D and E.

2.6 GmWRKY58的启动子分析

上述表达分析结果表明，转录因子GmWRKY58在非生物胁迫下存在一定功能，猜测其启动子序列上可能含有响应非生物胁迫的应答元件。在PlantCARE网站上预测GmWRKY58启动子的顺式作用元件，结果表明(表1)，GmWRKY58基因的启动子序列中含有多个响应逆境和植物激素的顺式作用元件，例如：ACE类似序列、MBS核心序列、HSE核心序列、富含TC的重复序列、TGA盒和TATA盒等。这些调控元件暗示GmWRKY58在植物响应抗逆方面可能具有重要作用。

表1 GmWRKY58启动子上的顺式作用元件预测 Tab.1 The cis-acting elements in the promoter sequence of GmWRKY58

3 讨论与结论

转录因子调控类基因可以较快响应逆境胁迫[35]。本研究结果显示，大豆GmWRKY58基因受高盐、干旱、低N和缺Fe等多种逆境胁迫后在其根部强烈诱导表达，但表达模式不同，说明GmWRKY58基因在不同胁迫环境下可能具有不同的响应机制。根部组织对这几种胁迫更敏感，这可能与其最早受水分胁迫或渗透胁迫导致较快脱水有关。大豆GmWRKY75和GmWRKY6基因在低P、低N、低K和缺Fe胁迫下表达趋势基本一致，都呈先微弱下调再明显上调，但不同处理达到最高表达量的时间点不同[36]，与本研究中GmWRKY58基因的表达模式存在着很大差异，这可能是由于它们基因结构和氨基酸序列的差异导致WRKY转录因子具有多种基因功能。

本研究中，GmWRKY58基因在大豆的根、茎、叶、花和荚中均有表达，根、茎、叶中的表达量显著高于花和荚，这与前人的研究结果一致[30]，说明GmWRKY58对于大豆的营养与生殖器官发育都有一定的作用，但其发挥作用的大小、调控方式可能存在不同。

通过不同物种WRKY氨基酸序列同源性分析和 Blast 比对，结果表明GmWRKY58与大豆WRKY70之间序列一致性最高，其次为绿豆、鹰嘴豆、巨桉、毛果杨、胡杨、苹果、麻风树、可可，说明GmWRKY58在相同物种中保守性比在不同物种间保守性高；GmWRKY58基因在物种间进化过程中经受不同选择压力的选择。

蛋白质在细胞中的定位决定了其行使功能的部位。生物信息学预测GmWRKY58定位在细胞核中，本试验结果证实了这一预测，该结果与已报道的WRKY转录因子的亚细胞定位结果一致[30]，同时也与GmWRKY58作为转录因子参与调控基因的表达相吻合。

WRKY通过结合启动子上保守的W box 顺式元件来调节目标基因的表达[37]。通过分析GmWRKY58基因上游1 500 bp的启动子片段，发现其含有多个与干旱、光响应、热激等逆境胁迫和生长素、赤霉素、茉莉酸等激素相关的诱导元件。GmWRKY58的启动子区域含有2个干旱应答的顺式元件MBS，推测该基因在大豆响应抗旱胁迫，调节干旱的抗性方面具有一定的功能，本试验也证实了这一点，如PEG处理下，大豆根中的GmWRKY58在短时间内即受到强烈的诱导，表达量提高近20倍。同时，在启动子区域还含有1个参与防御和逆境响应的顺式元件TC-rich repeats，当外界环境存在如高盐、低N和缺Fe时，通过这个诱导元件，与逆境相关转录因子可以激活GmWRKY58基因和蛋白质的表达，GmWRKY58转录因子又可以调控下游与逆境胁迫相关的功能基因表达，从而降低不良环境对植物造成的伤害。

大豆GmWRKY58基因开放阅读框长度为954 bp，编码317个氨基酸。GmWRKY58转录因子定位于细胞核中。GmWRKY58基因在根、茎、叶、花和荚等组织均有表达，种子中不表达，根茎叶中的表达量显著高于花和荚。该基因明显受高盐、干旱、低N和缺Fe胁迫诱导表达，说明GmWRKY58在大豆的抗盐、抗旱、低N和缺Fe等非生物胁迫响应中起到重要的作用。

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