Ecc36菌株hrpN基因的克隆、表达及HrpNEccPR蛋白的生物学活性

贾振华，刘 方，宋 聪，黄亚丽，马 宏 ，宋水山

(1.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，河北 石家庄 050081)

hrp基因(hrp，Hypersensitive response and pathogenity gene)广泛存在于革兰氏阴性植物病原细菌中，能够表达一种热稳定性Harpins蛋白，该蛋白不仅能够促进植物的生长发育[1-2]，也会引起非寄主植物的过敏反应(HR，Hypersensitive response)，Harpins蛋白能够广泛诱导植物对植物病虫害的防卫反应，增强植物的免疫反应[3-7]。研究表明，植物病原菌主要通过Ⅲ型分泌通路将Harpin蛋白分泌到植物细菌细胞外，能够激发非寄主植物的HR或诱导植物对病原菌产生抗病性[8-11]。因而，开发新型Harpin蛋白和研究Harpin诱导防卫机制已成为新研究热点。自1986 年Lindgren等[12]首次报道hrp基因以来，人们对hrp基因进行了广泛的研究。HarpinEa是一种从梨火疫欧文氏杆菌(Erwiniaamylovora)中分离到的Harpin蛋白，它能够诱发烟草HR反应[12-13]。1995年Cui等[14-15]借助分子生物学手段首次从胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovorasubsp.carotovora)Ecc71中分离到hrpN基因并克隆该基因。国内科研人员越来越多地研究Harpin蛋白和hrp基因，其中对来源于胡萝卜软腐欧文氏菌的Harpin蛋白的研究有了很大的进展，对其表达hrp基因克隆的研究也有了很大的突破，科研人员分别从E.carotovorasubsp.carotovoraCSSY002、carotovoraCSDS001以及betavasculorumCSL101等菌株中克隆到不同基因序列的hrp基因，这些hrp基因均能表达氨基酸序列不同程度差异的Harpin蛋白，但这几种Harpin蛋白均能诱导烟草过敏反应。携带hrp基因的不同植物病原菌携带的hrp基因具有一定的保守性，但也存在着很大的差异性，而其表达的Harpin蛋白对诱导不同的植物产生抗性也不同。本研究主要报道高致病性病原菌胡萝卜软腐欧文氏 (E.carotovorapv.carotovora) Ecc36菌株的胞外酶活性，对其致病性进行了鉴定，克隆了Ecc36菌株中的hrpNEccPR基因，并进行了筛选和测序，通过构建的pET30a-EccPR质粒在大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)中高效IPTG诱导表达HrpNEccPR蛋白，鉴定产物HrpNEccPR蛋白的生物学活性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

Ecc36菌株由河北省科学院生物研究所生物工程实验室收藏；大肠杆菌工程菌株BL21(DE3) (大连宝生物工程有限公司)；pET28a(+)质粒(大连宝生物工程有限公司)；LB培养基利用文献[9-10]中的方法进行配制；抗性培养基为LB培养基中加入50 μg/mL卡那霉素(Km)。提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；DNA 纯化试剂盒(Qiagen公司)；DNA标记系统(Promega公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株Ecc36 胞外酶的检测 参考文献[15-16]配制菌株Ecc36胞外酶的琼脂固体平板培养基，利用文献[17]中的方法检测Ecc36菌株分泌的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，Peh)、蛋白酶(Protease，Prt)、纤维素酶(Cellulase，Cel)及果胶酶(Pectate lyase，Pel)活性。通过平板上菌落周围的透明圈大小分析酶活性水平。

1.2.2 菌株Ecc36 对植物的致病性 挑取Ecc36菌株单菌落，培养24 h后，用无菌水将菌体稀释成5×109cfu/mL的菌悬液，利用悬浮液接种于大白菜，每个孔接种0.05 mL，28 ℃保湿培养，48 h后根据大白菜软腐程度判断菌株致病情况。

1.2.3 菌株Ecc36 过敏反应测试 将菌株Ecc36单菌落接种到LB 液体培养基，将菌株28 ℃培养24 h后，用无菌10 mmol/L氯化镁溶液稀释成2×108cfu/mL菌悬液，采用0.3 mL菌悬液注射到烟草叶片的方法来检测Ecc36过敏反应活性，用无菌10 mmol/L氯化镁溶液作为对照。接种24 h后，观察烟草叶片是否出现坏死斑现象。

1.2.4hrpNEccPR基因的鉴定 利用Southern杂交方法鉴定hrpNEccPR基因，用EcoRⅠ消化Ecc36菌株染色体DNA，以地高辛标记的Ecc36菌株hrpNDNA为探针进行Southern杂交。杂交条件见参考文献[18]。

1.2.5 携带hrpNEccPR工程菌的构建 参考hrpNEcc71基因，合成文献[19]中报道的hrpNEcc71上下游引物，进行PCR 扩增，反应条件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环25次。将纯化的PCR产物，经内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ进行酶切构建到质粒载体pET30(+)上，形成了pET30a-EccPR表达质粒。基因测序由上海生工完成，根据测序结果，hrpNEccPR基因进行分析。基因扩增和克隆方法见文献[20-22]。将质粒pET30a-EccPR转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构建高效表达的大肠杆菌工程菌。

1.2.6 HrpNEccPR的诱导表达及检测 将工程菌BL21(DE3)在卡那霉素抗性的LB液体培养基中37 ℃培养，当培养菌液的OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为0.8 mmol/L的 IPTG进行诱导培养，8 h后，离心收集菌体，4倍体积的缓冲溶液重悬，煮沸10 min，收集上清液。

HrpNEccPR蛋白的12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测方法参照文献[23]。

1.2.7 HrpNEccPR的活性检测 利用HrpNEccPR蛋白分别配制浓度为100，50，25 μg/mL蛋白水溶液，分别接种到烟草叶片，24 h后检查HR枯斑，水为对照。

2 结果与分析

2.1 菌株Ecc36 的致病性及其过敏反应

菌株Ecc36 是一种软腐病致病菌株，其致病性由植物细胞壁降解酶类(Plant cellwall-degrading enzymes，PCWDEs) 决定[24-25]，这些酶类分别为果胶酶(Pel)、多聚半乳糖醛酸酶(Peh)、蛋白酶(Prt)和纤维素酶(Cel)。胞外酶检测结果显示，Ecc36菌株能分泌Pel、Peh、Prt、Cel，且这4种酶具有较高活性(图1)。将Ecc36菌株接种于大白菜并温育48 h，大白菜出现明显的软腐病斑块，而对照(CK)不产生软腐病症(图2)，说明Ecc36菌株具有较强致病性，也推断出Ecc36菌株高致病性可能与胞外酶的活性有关系。为了检测Ecc36菌株过敏反应症状，将Ecc36菌株接种于烟草叶片，以MgCl2为阴性对照，试验结果表明，Ecc36菌株培养液及上清液均能引起烟草的过敏反应(图3)，说明Ecc36菌株分泌物中含有Harpin蛋白或者相似的物质。

图1 Ecc36菌株分泌的胞外酶Fig.1 Extracellular enzymes produced by Ecc36

图2 Ecc36菌株引起大白菜软腐Fig.2 Soft rot caused by Ecc36 in chinese cabbage tissue

2.2 hrpNEccPR 基因的鉴定及克隆

成地高辛标记的hrpN基因核苷酸序列探针，建立Ecc36基因文库，通过菌落原位杂交技术，对Ecc36基因文库进行筛选。图4显示，从该文库中筛选出3个阳性克隆菌，分别为34号、63号和89号克隆菌斑。通过EcoRⅠ消化的89号菌斑(Ecc36-89)染色体DNA、Ecc71 DNA和大肠杆菌BL21 DNA，进行Southern杂交，试验结果显示，Ecc71具有阳性杂交带片段，Ecc36-89也出现了阳性杂交带片段，而阴性对照大肠杆菌BL21染色体DNA没有出现阳性克隆杂交带(图5)。结果表明，Ecc36基因组中含有hrpN基因。

A.MgCl2溶液；B.Ecc36培养液；C.Ecc36培养液上清液。A. MgCl2 solution；B. Culture solution with Ecc36；C. Supernatant of Ecc36 culture solution.

图4 原位杂交结果Fig.4 In situ hybridization

图5 hrpN基因Southern 杂交Fig.5 Southern Blot analysis of hrpN gene

2.3 hrpNEccPR 基因的核苷酸序列及HrpNEccPR 蛋白的氨基酸序列

将Ecc36-89基因组中克隆的hrpN基因命名为hrpNEccPR基因，hrpNEccPR基因测序结果表明，其编码开放阅读框(ORF)为1 254个核苷酸(图6)，与来自其他hrpNEch、hrpNEcc编码基因相比分别具有87.8%和86.6%的序列同源性。

hrpNEccPR基因编码的蛋白HrpNEccPR由417个氨基酸残基组成，理论分子量45.27 ku，理论等电点5.73，序列中富含甘氨酸(G)。Ecc36 与其他几个菌株来源的hrpN编码氨基酸序列(HrpNEch、HrpNEcc)同源性较高，通过和其他hrpN基因编码的蛋白序列相比较，同源性达到43%(图7)，而且C末端和N末端的同源性非常高，推测是其功能区域。这也和hrpN基因编码的蛋白功能一致，说明了生物的遗传多样性。

图6 hrpNEccPR基因序列Fig.6 HrpNEccPR gene sequence

图7 HrpNEccPR蛋白序列Fig.7 hrpNEccPR protein sequence

2.4 携带hrpNEccPR 基因的工程菌诱导表达

将hrpNEccPR基因构建在pET30a，命名为pET30a-EccPR，并转入BL21(DE3)中，获得大肠杆菌工程菌BL21(pET30a-EccPR)，经IPTG诱导表达工程菌BL21(pET30a-EccPR)，SDS-PAGE(浓度为12%)蛋白电泳结果显示(图8) ，含有空载体质粒的BL21(DE3)大肠杆菌经IPTG诱导后不产生目的蛋白条带，工程菌BL21(pET30a-EccPR)经IPTG诱导能够产生目的条带，不经IPTG诱导，也不会产生HrpNEccPR蛋白目的条带。这些结果表明，工程菌在IPTG诱导下能够表达HrpNEccPR蛋白。

2.5 HrpNEccPR 蛋白诱导过敏反应

植物过敏反应已经成为检测一种蛋白或者小分子化合物具备Harpin类蛋白条件的一种重要生物测试方法，为检测HrpNEccPR蛋白的生物学活性，将纯化的HrpNEccPR蛋白(图8)接菌于烟草叶片，结果显示，纯化的HrpNEccPR蛋白能诱导烟草叶片产生过敏反应(图9)，这与已报道的其他Harpin类蛋白的生物学活性一致，也说明HrpNEccPR蛋白是Harpin类蛋白的一种。试验结果也显示，HrpNEccPR蛋白诱发的植物过敏反应斑块大小与其浓度有关，随着HrpNEccPR蛋白浓度的增加，过敏反应病斑随之扩大，50 μg/mL的HrpNEccPR蛋白即能显著诱导过敏反应，而对照处理不引起过敏反应。

M.Marker； 1.BL21(DE3)/ pET-28a(+) + IPTG ； 2.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR；3.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR+IPTG ； 4.提纯的HrpNEccPR蛋白。

M.Marker； 1.BL21(DE3) carrying pET28a(+) + IPTG； 2.BL21(DE3) carrying pET30a-EccPR，no IPTG； 3.BL21(DE3) carryingpET30a-EccPR+IPTG； 4.Purified HrpNEccPR.

图8HrpNEccPR蛋白在工程菌中的IPTG诱导表达
Fig.8ExpressionofHrpNEccPRinducedbyIPTGinengineeringstrain

A.水；B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR 200 μg/mL；D. HrpNEccPR 100 μg/mL。A.H2O； B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR200 μg/mL； D.HrpNEccPR 100 μg/mL.

3 讨论与结论

Harpin蛋白是一类这些年来一直被关注的重要生物效应分子，Cui等[17]通过胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Ecc71研究发现了由hrp基因编码的Harpin 蛋白，该蛋白是引发非寄主植物过敏性反应的重要因子，试验也证明，该蛋白能够诱导烟草叶片产生过敏反应，因而，hrp基因的遗传组成、表达调控及产物、功能已成为研究该领域的重点内容。通过对植物细胞壁降解酶类检测和分析，发现胡萝卜软腐欧文氏Ecc36菌株具有很强的胞外酶分泌活性，能够降解植物细胞壁[26]，也是Ecc36的关键致病因子。hrpNEccPR基因测序结果显示，与其他几种来源于胡萝卜软腐欧文氏菌的Harpin蛋白编码基因序列具有很高的同源性，HrpNEccPR蛋白的氨基酸序列分析表明，其氨基酸序列与HrpNEcc蛋白、HrpNEch蛋白序列具有很高的同源性。而通过工程菌高效表达的HrpNEccPR蛋白仍具有Harpin蛋白的活性，能诱导植物产生HR反应，这些结果表明，HrpNEccPR蛋白能够提高植物本身的免疫机能，诱导植物对胁迫环境产生抗性。Harpin蛋白主要来源于革兰氏阴性植物病原细菌，在梨火疫欧文氏杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中也存在Harpin蛋白表达基因，张珏等[20]报道了HarpinCSDS001诱导植物抗性、促进植物生长发育的作用机制，曹茂林等[27]报道了胡萝卜欧文氏菌CSSY002表达的Harpin蛋白生物学活性，Kariola等[28]报道，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种细菌产生的Harpin蛋白能够诱导拟南芥的防卫反应。HrpNEccPR蛋白是胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株表达的蛋白激发子，它能诱导植物产生免疫反应，使植物发生过敏坏死反应，笔者正在通过室内和田间试验研究HrpNEccPR蛋白的抗病性、抗虫性、抗逆性、促进生长和发育等特性。希望通过这一系列的基础和应用研究，能将HrpNEccPR蛋白开发成新型、安全、高效的植物诱抗剂，使HrpNEccPR蛋白在未来的农业高新生物技术领域中扮演重要角色。

利用烟草验证了胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株能够引起过敏反应(HR)，克隆了Ecc36菌株的hrpN基因(hrpNEccPR基因)的开放阅读框，通过基因测序和比对，与其他软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性，表明hrpNEccPR基因表达的蛋白具有Harpin蛋白特性。构建hrpNEccPR基因表达载体(pET30a-EccPR)，并获得表达HrpNEccPR蛋白大肠杆菌工程菌，诱导获得的HrpNEccPR蛋白纯化后，具有激发植物免疫反应的生物活性。

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