固相萃取-高效液相色谱法测定大鼠尿样中调环酸钙

马安萍， 陈红红*， 阮小林， 丘静静， 吴邦华

(1.广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310；2.广东省职业病防治院，广东省职业病防治重点实验室，广东广州 510310)

调环酸钙(Prohexadion-calcium)化学名称3,5-二氧代-4-丙酰基环己烷羧酸钙，它是一种新型的环己酮类植物生长调节剂[1 - 2]，具有促进农作物生育，提高作物产量，增强植株的抗病害能力以及减轻倒伏等作用[3 - 7]，其纯品为无色或白色晶体，原药外观为米色或浅黄色无定形固体，易溶于甲醇和水[1]。调环酸钙作为一种植物生长调节剂被广泛应用到农业生产中，尽管调环酸钙毒性相对较低，但是若使用不当或者长期接触仍会对人体造成伤害。目前国内外关于调环酸钙的报道多见于其对农作物的生长调控，而关于调环酸钙检测方法的报道较少[8 - 10]，尤其是生物材料中调环酸钙的检测未见报道。本实验通过固相萃取提取净化尿样中的调环酸钙，样品前处理步骤简单，并通过对高效液相色谱(HPLC)条件的优化实现了尿样中调环酸钙的分离分析。该方法准确度和精密度均能达到生物材料中定量分析的要求，适合于尿样中调环酸钙的测定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；AUY220电子天平(日本，岛津公司)；固相萃取小柱:Waters OasisMAX( 3cc，美国Waters公司)，Waters OasisHLB(3cc，美国Waters公司),Supelclean LC-SAX 3 mL(上海安普科学仪器有限公司)。

调环酸钙标准品(纯度 ≥ 98%)；甲醇为色谱纯；甲酸、磷酸均为分析纯(广州化学试剂厂)；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制准确称取调环酸钙标准品0.0200 g，置于10 mL容量瓶中用7%磷酸-甲醇溶液定容至刻度，得到2.00 mg/mL的标准贮备液。临用前用甲醇稀释成100.00 μg/mL标准溶液。

1.2.2样品前处理Water OasisMAX固相萃取小柱分别用3 mL甲醇和3 mL水依次活化；将尿样于室温下缓慢解冻混匀，移取0.50 mL至上述活化好的柱上，在自然重力下过柱。依次用1 mL 10%甲醇水溶液、1 mL甲醇淋洗小柱，负压抽干2 min；再用2 mL 1%甲酸水溶液-甲醇洗脱至5 mL聚乙烯塑料管，混匀后取待测液1 mL至2 mL进样瓶中，待测。

1.2.3高效液相色谱条件色谱柱：Agilent-Poroshell 120 EC-C18柱(100×4.6 mm，2.7 μm)；流动相：A相为0.01%甲酸水溶液，B相为甲醇。梯度洗脱；初始90%A、10%B；20 min内逐渐变为30%A、70%B，保持2 min；25 min逐渐变为初始条件并保持3 min；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；检测波长：275 nm。在该条件下，调环酸钙标准品的保留时间为18.74 min。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

图1 尿样加标色谱图和空白尿样的色谱图Fig.1 Chromatogram of spiked urine and blank urine----:spiked urine;:blank urine.

调环酸钙易溶于甲醇，故实验选择甲醇水溶液作为流动相，根据调环酸钙的结构可知其在尿中多以离子形式存在，在C18色谱柱保留较差，含水流动相中加酸可改变其极性，改善其在色谱柱中的保留情况[2]，因此在水相中加入0.01%的甲酸。在流动相流速为0.4 mL/min的条件下考察不同体积比的甲醇水溶液对尿样中调环酸钙的分离情况。实验结果表明采用等度洗脱时，目标组分和内源性干扰组分不能完全分离，而在梯度洗脱条件下可以完全分开且无内源性干扰，最终确定流动相梯洗条件见1.2节。优化条件下加标尿样和空白尿样色谱图见图1。

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1固相萃取小柱的选择实验考察了Water OasisMAX、Water OasisHLB和Supelclean LC-SAX三种不同固相萃取小柱对尿样中调环酸钙的净化效果。结果显示在常规的淋洗洗脱条件下，MAX柱就能取得相对较好的净化效率，回收率达到95%左右。而HLB柱回收率低于5%，LC-SAX柱在淋洗过程中，待测物几乎全部被洗出。综合以上选择MAX柱净化尿样中的调环酸钙。

2.2.2淋洗液选择选择10%、20%甲醇水溶液以及甲醇为淋洗液，实验发现在2～3 min内洗出杂质峰的峰形、响应值以及峰的个数基本相同，因此选用10%甲醇水溶液和甲醇作为淋洗液。考察淋洗液用量发现，淋洗液1 mL即可实现待测物与其他物质分离，因此选用1 mL的淋洗液。

2.2.3洗脱溶剂的选择选择1%甲酸-甲醇溶液，利用溶液中高浓度的甲酸根离子将阴离子柱上分析物通过离子交换洗脱下来。对不同浓度甲酸-甲醇溶液的洗脱效果进行考察，结果表明随着洗脱液中甲酸浓度的增加，回收率逐渐增高，当甲酸的浓度增加到1%时，回收率最高，因此洗脱液选择1%甲酸-甲醇溶液。进一步实验发现2 mL洗脱液可将待测物全部洗出，回收率达95%，故选择洗脱液的用量为2 mL。

2.3 线性范围及检出限

取6只具塞聚乙烯塑料管，分别加入0、1 、2.5、10、25、50 μL的标准溶液，每管各加入0.5 mL的尿样，配成标准系列溶液。采用实验方法以调环酸钙的浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制工作曲线，其回归方程为：Y=0.004565X+0.5507，本方法检测尿样中调环酸钙的质量浓度在0.20～5.00 μg/mL范围呈线性关系，相关系数R2=0.999，检出限为0.06 μg/mL，定量限为0.10 μg/mL。

2.4 精密度和回收率的考察

取低、中、高(0.60、2.00、3.50 μg/mL) 3个浓度的加标尿样，按照上述前处理方法处理，HPLC法测定。日内精密度(RSD)分别为3.89%、2.14%和2.86%。日间RSD分别为6.67%、7.58%和5.01%。大鼠尿样中分别加入低、中、高(0.60、2.00、3.50 μg/mL) 3个浓度的调环酸钙溶液，按照上述方法处理和测定，考察方法的回收率，回收率分别为104.94%、103.41%和96.41%。

2.5 方法应用

在大鼠饲料中添加一定质量调环酸钙原药(10 μg/mL)，并给3只行为无异常且体重相近(约400 g)的大鼠喂食，分别在其染毒后的第2、6、12、24、48、72、96、120 h收集尿样，用本方法进行测定，结果见表1。

表1 实际样品测定结果(n=3)

-：not detected.

3 结论

本文建立的尿样中调环酸钙的测定方法具有灵敏度高、精密度好、样品前处理简单的特点，方法的各项指标均符合国家标准(GBZ/T 210.5-2008)《职业卫生标准制定指南第五部分：生物材料中化学物质测定方法》的要求，适用于尿中调环酸钙的定量检测。

参考文献：

[1] YI M.Pesticide Science and Administration(佚名.农药科学与管理),2011,32(3):60.

[2] ZHENG X F,ZHAO D S,SUN B J,et al.Journal of Southern Agriculture(郑先福，赵东生，孙炳剑，等.南方农业学报),2011,42(4):288.

[3] DU L T,FAN T Q,WANG C B,et al.Journal of Peanut Science(杜连涛，樊堂群，王才斌，等.花生学报),2008,37(4):33.

[4] WEI M,JIN H G,ZHANG S B.Pesticide Science and Administration(魏民，金焕贵，张世斌.农药科学与管理),2011,32(9):55.

[5] WANG H Y,XU Z J,ZHANG L Z,et al.Journal of Agriculture(汪洪洋，徐宗进，张立智，等.农学学报),2010，(4):20.

[6] Kim H Y,Lee I J,Hamayu M.Journal of Agronomy and Crop Science,2014,193(6):445.

[7] Kavalier A R,Ma C,Figueroa M.Food Chemistry,2014,145:254.

[8] WEI J,XING Y J,CHEN R H,et al.Agrochemicals(韦婕，行艳景，陈荣华，等.农药),2015,54(7):528.

[9] ZHENG X F,QIAN T Y,ZHENG H,et al.World Pesticides(郑先福，骞天佑，郑昊，等.世界农药),2014,36(2):251.

[10] LI Y,WANG S X,SHI N,et al.Pesticide Science and Administration(李岩，王胜翔，史娜.农药科学与管理),2012,33(9):40.