甜糯双隐基因型玉米材料的创制方法及鉴定技术概述

宋俏姮 孔亮亮 刘俊峰 张 垚 杨跃华

（四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川德阳 618000）

随着社会经济的持续发展和人民生活水平的不断提高，人们对鲜食玉米的品质提出了更高的要求。为了适应不同地区和不同人群的消费需求，近些年我国育成了甜加糯型这一新型鲜食玉米品种。甜加糯型鲜食玉米作为一种新兴的消费食品，深受广大消费者喜爱。甜糯双隐基因型玉米自交系是配制甜加糯型鲜食玉米的必备材料。在选育甜糯双隐基因型玉米自交系的基础上，通过与单（多）隐性纯合体杂交组配，即可获得甜（杂结合）糯（纯结合）玉米杂交种，播种后收获的果穗即为甜加糯型鲜食玉米（苏彩霞 等，2013）。目前关于甜糯双隐基因型玉米的研究仍处于摸索阶段，本文对甜糯双隐性玉米材料的创制方法及鉴定技术进行了系统的综述和探讨，以期解决选育甜加糯型鲜食玉米的技术瓶颈，提高育种效率和育种的预见性。

1 甜加糯型鲜食玉米的市场价值及甜糯双隐基因型玉米材料的研究进展

鲜食玉米是指在乳熟期采收，经简单的加工即可食用的玉米，包括甜玉米、糯玉米、甜加糯型玉米等（滕宏飞和狄广霞，2007），属于主要农作物中特殊用途的玉米类型。2016年农业部印发的全国种植业结构调整规划中明确提出适当发展鲜食玉米，到2020年鲜食玉米种植面积达到100万hm2（1 500万亩）。鲜食玉米风味独特，适口性好，富含人体所需的多种营养成分，在农业生产和人民生活中受到越来越多的重视，消费量和种植面积也越来越大（张胜恒 等，2004；汪黎明 等，2005）。

甜加糯型玉米是满足“既甜又糯”消费需求的鲜食玉米新类型，同一果穗上甜、糯籽粒随机相间排列，入口兼具甜味与糯性，市场份额占比鲜食玉米市场1/3以上，且呈逐年上升趋势，市场价值高于传统的甜玉米、糯玉米20%以上，经济效益比普通玉米提高2～3倍（王萍 等，2016）。甜加糯型鲜食玉米产业发展尚处于起步阶段，有着良好的发展前景和巨大的市场空间。目前玉米品种审定中，甜加糯型鲜食玉米仍作为特殊类型品种中的糯玉米组别参与审定。

甜糯双隐性纯合体是配制甜加糯型鲜食玉米必备的中间材料。玉米籽粒的甜味是由隐性纯合的sh2sh2、susu、aeae等基因效应引起的；玉米的糯性则由隐性糯质基因waxy控制，纯合wxwx基因型产生几乎100%的支链淀粉，这种淀粉具有很强的糯性（刘纪麟，1991）。谢孝颐等（2003）利用糯玉米与甜玉米杂交，在F2中分离出甜糯双隐性纯合体（wxwxsh2sh2）与糯玉米回交，后代果穗同时含有糯籽粒和甜籽粒。刘纪麟（1991）报道某些双隐性基因突变体可集中2个单隐性基因突变体各自的特点。吴子恺（2003）提出异隐纯合体杂交法（已申请专利）组配甜加糯型鲜食玉米，首先培育控制玉米胚乳性状的双隐基因型纯合体，再利用其与不同的单（多）隐性纯合体杂交，使不同基因型的甜糯粒在果穗上同时存在。利用双隐基因型纯合体材料与其他不同类隐性基因型纯合体材料杂交，获得三（多）隐性纯合体，根据需要通过不同隐性纯合体彼此间杂交调节甜加糯型玉米果穗上的甜、糯籽粒比例，目前常用比例为1∶3、7∶9或4∶3（吴子恺 等，1997）。郝小琴和吴子恺（2003）测定了甜糯双隐性纯合体su1wx、sh2wx的农艺性状并分析了基因互作效应，结果显示纯合体sh2wx的含糖量高于sh2，纯合体su1wx的含糖量低于su1，纯合体su1wx不能直接加以组配利用，且甜糯双隐性纯合体在实际品尝中风味与甜玉米类似，无糯性口感。从遗传连锁关系上分析，可以将甜质基因与糯质基因转育到同一自交系中，获得甜糯双隐性纯合体，且waxy表现出上位性效应，waxy基因与其他甜质基因组合的籽粒中基本为支链淀粉；而从基因互作的角度看，甜质基因在糖分积累和淀粉总量上具有隐性上位作用，籽粒表现为甜质，外观和口感难以体现糯性（吴子恺，2003）。因此，从市场应用的角度出发，甜糯双隐性纯合体只能被育种者作为中间材料加以选择利用。

2 甜糯双隐基因型玉米材料的创制方法

2.1 常规甜、糯杂交组配（以sh2sh2wxwx为例）

选取优良糯玉米（Sh2Sh2wxwx）和优质超甜玉米（sh2sh2WxWx）杂交，F1获得普通玉米种子（Sh2sh2Wxwx），后代植株选株自交或姊妹交，依据遗传自由组合定律，果穗上有9/16普通玉米籽粒（Sh2_Wx_）、3/16糯 质 籽 粒（Sh2_wxwx）、4/16甜质籽粒，这部分甜粒需进一步鉴定基因型（其中3/16 sh2sh2Wx_超甜玉米籽粒，1/16 sh2sh2wxwx甜糯双隐性籽粒）（吴子恺，2003）。同时，还可以从F2中选择3/16的糯质籽粒播种，继续自交，1/3的果穗表现全糯（Sh2Sh2wxwx），2/3的果穗分离出3/4糯质籽粒（Sh2_wxwx），1/4表型为甜质的双隐性籽粒（sh2sh2wxwx）（苏彩霞 等，2013）。选择出的甜糯双隐性玉米种质连续套袋自交，进一步纯化繁殖成甜糯双隐基因型玉米自交系（图 1）。

图1 常规甜、糯杂交组配甜糯双隐基因型玉米材料

2.2 甜加糯（商品种）二环系选育法

收集和引进国内外优良的甜加糯型鲜食玉米品种进行自交，在F1果穗上选取1/4表型为甜质的籽粒继续自交，得到甜糯双隐性自交系。这种甜糯双隐性系以杂合状态存在于甜加糯型鲜食玉米杂交种（表型为糯籽粒）中，自交1代即可分离出甜糯双隐性纯合系（徐勇 等，2009）。或者，甜玉米与糯玉米杂交后的F1套袋自交，分别选出糯质籽粒和甜质籽粒，播种后进行姊妹交，使之形成双隐性基因，选取后代表型为甜质的双隐性籽粒播种，连续自交选择，待性状稳定一致后获得甜糯双隐性纯合自交系（卢华兵 等，2010；卢柏山 等，2016）。

3 甜糯双隐基因型玉米材料的鉴定方法

甜糯双隐性纯合体籽粒外观为甜质型，在实际品尝中，风味和甜玉米相近，仅从外观和口感难以判断甜糯双隐性玉米材料。如何快速准确地鉴定甜糯双隐基因型纯合体是育种者面临的技术难题。

3.1 测交鉴定法

测交鉴定法是目前应用最广泛的鉴定方法。遵循隐性基因遗传规律，采用糯玉米作为测验种，通过杂交，观察当代种子籽粒类型，鉴别出表型均为甜质的甜糯双隐基因型玉米材料或甜玉米材料（刘亚利 等，2011）。糯玉米与甜糯双隐性玉米杂交产生的果穗籽粒表型为糯质，与甜玉米杂交产生的果穗籽粒为普通型。挑选出当代种子籽粒类型为糯粒的双隐性纯合体，进一步纯化繁殖（图2）。

图2 测交鉴定甜糯双隐基因型玉米材料

3.2 SSR分子标记鉴定法

SSR（simple sequence repeat）即简单序列重复标记，也被称为微卫星序列标记（microsatellite sequence）、短串联重复标记（short tendom repeat）或简单序列长度多态性（simple sequence length porlymorphism），是以PCR技术为核心的DNA分子标记技术，通常由2～5个核苷酸组成串联重复单位，也有少数由1～6个核苷酸为单位组成多次串联重复的DNA序列（俞琦英和包斐，2010）。SSR标记技术通过寻找与目标基因或QTL紧密连锁的分子标记，进行基因精确定位，通过与目标基因紧密连锁的特定分子标记，对某特定性状基因型跟踪检测，在后代群体中判断出含有目标基因的个体（李丽 等，2008；杨留启和杨文鹏，2008）。

玉米糯性是淀粉修饰基因waxy发生隐性突变，籽粒胚乳中直链淀粉几乎完全缺失造成的突变性状（姚坚强 等，2013）。已公布的糯玉米隐性基因（waxy）序列长3 868 bp，位于玉米第9染色体。甜糯双隐性纯合体籽粒中几乎全为支链淀粉，呈糯性，淀粉总量少，籽粒表型为甜质，需借助鉴定手段判定其基因型。李新海等（2003）报道了位于9.03染色体位置，与糯玉米隐性基因（waxy）紧密连锁的3对SSR标记引物：phi022、phi027、phi061。杨耀迥等（2010）基于SSR分子标记辅助选择技术成功鉴定出含有sh2sh2wxwx基因型的甜糯双隐纯合体玉米单株9株，经过4代连续自交后得到稳定的甜糯双隐基因型玉米自交系。甜糯双隐性纯合体籽粒表型为甜质，默认其含有甜质基因，利用与糯玉米隐性基因waxy紧密连锁的SSR标记引物，从中找出含有糯质基因的个体，即为甜糯双隐性玉米种质。具体操作：首先选择并合成与糯质基因紧密连锁的SSR标记引物，将供试材料播种待其长至4～6叶期取材，以优良糯玉米自交系的叶片作为对照，提取DNA，利用相应的标记引物进行PCR扩增，扩增产物在电泳结果中与对照具有相同条带的即为含有wxwx基因型的单株样品，在田间对应编号的植株即为双隐性纯合sh2sh2wxwx基因型甜糯玉米自交系单株。

4 讨论与展望

4.1 不同甜糯双隐性玉米材料创制方法对比

常规甜、糯杂交组配法和甜加糯（商品种）二环系选育法是目前最常用的双隐性材料创制方法。常规甜糯杂交组配在F1果穗上选择甜粒，其中有1/16的甜糯双隐性玉米籽粒，该法所需代次较少，分离比例较高，但由于外观难以与甜籽粒相区分，需进一步鉴定基因型，增加工作环节。常规甜糯杂交组配在F1果穗上选择3/16的糯质籽粒自交，F2有2/3的果穗分离出1/4的甜糯双隐性玉米籽粒，可直接选择出甜糯双隐性纯合体，无需基因型鉴定；缺点是所需代次较多，分离比例仅1/32，且在F1果穗上人工挑选种皮颜色为黄色的糯质籽粒时，外观与分离出的普通籽粒相似，容易出现一定概率的误选。甜加糯（商品种）二环系选育法在F1果穗上选取1/4表型为甜质的籽粒即为甜糯双隐性纯合体，所需代次少，分离比例高，但是长期利用二环系法选育甜糯双隐性自交系，容易造成自交系间亲缘关系交错，遗传基础逐渐狭窄，遗传差异缩小，难以大幅度提高新自交系的一般配合力和特殊配合力，后续选育的杂交组合在产量、品质和抗性方面很难有质的飞跃（卢华兵 等，2010）。

4.2 不同甜糯双隐性玉米材料鉴定方法对比

选育甜糯双隐基因型玉米自交系的过程中，及时判断材料是否为双隐性纯合体是进行后续工作的前提。测交鉴定法是育种工作者最常采用的鉴定方法，观察早代材料的田间表现情况，根据育种目标有针对性地挑选植株进行测交鉴定，鉴定出的甜糯双隐性纯合体进入正常育种程序；同时可将测交鉴定与配合力测定结合，确保入选的高配合力自交系含有目标甜糯双隐性基因（郝德荣 等，2016），但是测交鉴定工序繁琐，耗费时间长，工作量大，效率低下。SSR分子标记鉴定法利用与目标基因（waxy）紧密连锁的遗传标记对某特定性状（糯性）基因型进行选择，不受组织类别、环境条件和发育阶段影响，可以直接选择玉米基因型，在后代群体中直接筛选出含有目标基因（waxy）的个体，有效简化育种程序、降低成本，加速品种遗传改良的进程。但SSR分子标记鉴定法不能脱离常规育种手段单独使用，鉴定的准确率受到标记与基因遗传距离、材料遗传背景、PCR反应条件和引物特异性等因素影响（胡丹东和赵久然，2007）。

4.3 选育甜糯双隐性玉米自交系过程中存在的问题与展望

部分育种工作者对甜糯双隐性纯合体和甜加糯型玉米的认识仍存在一定程度的混淆，创制甜糯双隐性自交系为配制甜加糯型鲜食玉米提供了必备的种质资源，对加快甜加糯型鲜食玉米产业发展具有重要意义。目前多采用工艺复杂、效率低、周期长的传统方法进行选育，且双隐性材料存在种子活力差、出苗率低、植株长势弱、抗性差、籽粒果皮较厚等问题。在选育手段上可以尝试结合单倍体育种技术、分子育种手段或染色体融合技术，根据育种需要选择并创新不同的鉴定方法，以加快育种进程。针对种子出苗困难，需精细整地，合理密植，配套良好的田间肥水管理，重要材料可采用育苗盘单粒育苗，必要时增加发芽试验，选择最优发芽温度和播种深度。选择品质佳、高抗、广适、配合力高的亲本材料，并不断加强种质资源的挖掘引进与材料创新，建立相应的品质评价体系，以提高甜糯双隐性玉米自交系目标性状改良的精准性和选择效率。

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