高糖高脂抑制成骨细胞增殖及促进凋亡*

吴 娟 邱绮虹 杨骥锋 梁 敏

慢性牙周炎是口腔科常见疾病之一，牙槽骨破坏是其重要病理特征，最终导致牙松动、脱落。局部菌斑微生物是牙周炎的始动因子，而全身性因素如糖尿病、代谢综合征等系统疾病可促进牙周炎发展[1,2]。近年来研究表明，代谢综合征可加重牙周炎症状，增加失牙风险[3-6]。代谢综合征以腹型肥胖、高血压及糖脂代谢紊乱为特征，糖脂代谢紊乱常诱发高血糖高血脂[7]。Gong等发现高糖高脂通过抑制成骨分化相关基因的表达，削弱成骨细胞分化能力[8,9]，并增强破骨细胞骨吸收水平[10]。健康牙周状况下，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收处于平衡状态，维持牙槽骨的正常形态与功能。在实验性牙周炎动物模型中，成骨细胞凋亡增多导致新骨形成减少，影响牙槽骨的修复重建，加重牙槽骨缺失及牙周炎病情[11]。高糖高脂条件下，胰岛β细胞、心肌细胞及血管内皮细胞增殖活性下降，凋亡增加[12-15]，但鲜有文献报道，高糖高脂是否影响成骨细胞增殖及凋亡。我们前期实验发现，高糖高脂引起成骨细胞正常形态的改变，在此基础上进一步研究高糖高脂对成骨细胞增殖及凋亡的影响，为探讨代谢综合征促进牙周炎症加重的可能原因提供新思路。

1.材料与方法

1.1 实验材料 棕榈酸(PA)粉末(MPBiomedicals，美国)，D-葡萄糖(Sigma,美国)，小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14，中国科学院细胞库提供)，胎牛血清(Gibco，美国)，青霉素链霉素双抗(Gibco，美国)，α-MEM培养基(含D-glucose5.6mM，Gibco，美国)，CCK-8(Dojindo，日本)，Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(Biosciences，美国)，RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、小鼠β-actin一抗及氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(上海碧云天)，小鼠cleaved caspase-3、caspase-3一抗(Cell Signaling Technology，美国)。

1.2 高糖高脂溶液的配置 根据文献报道，研究者通常采用11mM-30mM糖浓度及或0.4mM棕榈酸处理肝细胞、巨噬细胞、肝癌细胞等，构建代谢综合征高糖高脂细胞模型[16-19]。称量棕榈酸(PA)粉末及NaOH共同溶于双蒸水，使NaOH终浓度为0.01M，棕榈酸终浓度为20.0mM，混匀后于70℃水浴30min得到PA/NaOH溶液。配置30%BSA溶液(w/v，溶于PBS)，按照BSA溶液和PA/NaOH溶液的体积比为33∶40混合得到PA/BSA的稳定储备液，存放于-20℃[20]。使用时，每2ml完全培养基加入5.2mg的D-glucose及73uL的PA/BSA储存液，0.22μm滤器除菌，最终得到D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液。

1.3 细胞培养 成骨细胞MC3T3-E1在含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗的α-MEM培养基中于5%CO2、37℃条件下培养，待细胞生长至80%-90%融合后传代进行实验。细胞培养分为两组：实验组使用含D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液，对照组使用含0.5%BSA的完全培养基(含D-glucose5.6mM)。

1.4 细胞形态观察 实验组(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)及对照组(D-glucose 5.6mM，BSA 0.5%)细胞培养24h、36h、48h后，分别在倒置相差显微镜(Axiovert 40,美国)下观察细胞形态学变化。

1.5 CCK-8检测细胞增殖 成骨细胞以1500个/孔接种至96孔板，培养24h后加入完全培养基或高糖高脂溶液处理0、12、24、36、48h，每组设5个复孔，每孔100ul培养基。将培养基和CCK-8按照体积比9∶1混合，去除处理液后每孔加入CCK-8混合液100uL，37℃避光孵育2h，450nm波长下检测吸光度值。实验独立重复3次。

1.6 Annexin V/PI双染流式检测细胞凋亡 成骨细胞以2×105个/瓶接种于25cm2培养瓶，每瓶3ml培养基，培养36h后高糖高脂(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)处理细胞 0、24、30、36h，依据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书，收集细胞，用1×Binding Buffer重悬调整细胞浓度至1×109/L，加入Annexin V和PI染液室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测，凋亡率=C4早期凋亡细胞率+C2晚期凋亡细胞率。实验独立重复3次。

1.7 Western blotting检测cleaved caspase3和caspase-3的表达 成骨细胞以2×105个/瓶接种于25cm2培养瓶，每瓶3ml培养基，培养36h后高糖高脂(D-glucose 20mM,PA 0.4mM，BSA 0.5%)处理细胞 0、6、12、24、36h，RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样本蛋白浓度，按照每泳道35ug总蛋白，10%SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，4℃孵育小鼠 cleaved caspase-3、caspase-3(1∶1000)及小鼠β-actin一抗(1∶1000)16至18h，常温孵育氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(1∶1000)1h，Image Auant Las4000mini超灵敏化学发光成像仪(GE Healthcare，瑞典)检测，Image J软件(美国国立卫生研究院)进行条带灰度值检测与分析。目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值，其中β-actin为内参。实验独立重复3次。

1.8 统计学分析 采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析，统计数据采用均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(one w ay ANOVA)，LSD法进行两两比较，以双侧p＜0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1 高糖高脂引起成骨细胞形态改变 倒置相差显微镜下观察，对照组成骨细胞轮廓清晰，呈梭形或多角形，细胞间呈铺路石样紧密连接(图1A-图1C)。高糖高脂培养24h时观察到细胞变得稀疏，形态皱缩，胞间间隙增宽，且随培养时间延长，该现象更加明显(图1D-图1F)，提示高糖高脂可改变成骨细胞正常形态。

2.2 高糖高脂抑制成骨细胞增殖 图2所示，培养成骨细胞0、12、24、36、48h，CCK-8检测发现对照组细胞呈指数式增殖，高糖高脂组24h时吸光度值(0.065±0.013)较同时刻对照组(0.237±0.048)降低，差异有统计学意义(F24h=24.489，P=0.001)，36、48h分别降低至0.032±0.022和0.027±0.022，与同时刻对照组相比差异更显著(F36h=124.319，p＜0.001；F48h=272.440，p＜0.001)，提示高糖高脂呈时间依赖性抑制细胞增殖。

图1 高糖高脂处理24、36、48h后成骨细胞的形态变化

图2 高糖高脂处理成骨细胞0-48h后的增殖活性

2.3 高糖高脂促进成骨细胞凋亡 高糖高脂处理成骨细胞0、24、30、36h后，Annexin V/PI双染流式检测细胞凋亡，凋亡率=C4早期凋亡细胞率+C2晚期凋亡细胞率(图3A)。图3B所示，高糖高脂组24h时凋亡率(9.68%±3.33%)与对照组(1.96%±1.32%)相比差异有统计学意义(F=6.274，P=0.022)，36h时凋亡率(12.89%±3.40%)上升至对照组6.6倍(P=0.004)，提示高糖高脂呈时间依赖性促进成骨细胞凋亡。

图3 高糖高脂培养0-36h后成骨细胞凋亡情况

2.4 高糖高脂上调cleaved caspase-3蛋白水平 Western blotting结果显示，健康成骨细胞表达caspase-3，在相对分子量为35k Da处可见清晰条带，但极少表达活化的cleaved caspase-3；高糖高脂时间依赖性上调cleaved caspase-3蛋白水平，在17k Da处可见逐渐增强的条带，caspase-3蛋白水平不变(图4A)。图4B所示，高糖高脂处理成骨细胞24h后，cleaved caspase-3相对表达量(0.349±0.068)较对照组(0.146±0.033)升高约2.4倍(F=9.603，P=0.016)，36h时蛋白水平(0.468±0.136)约为对照组的3.2倍，差异更显著(F=9.603，P=0.001)，提示高糖高脂呈时间依赖性上调cleaved caspase-3表达,与细胞凋亡相呼应。

图4 高糖高脂处理成骨细胞0-36h后caspase-3、cleaved caspase-3蛋白水平

3.讨论

大量研究表明，代谢综合征与牙周炎相互影响。Iwasaki等发现，代谢综合征可增加牙周炎的发病风险[5]。高密度脂蛋白胆固醇降低、空腹血糖升高及腹部肥胖这三项危险因素与牙周疾病密切相关，牙周炎患者合并有代谢综合征时，牙周袋加深，附着丧失加重[3]。同时，牙周健康状况与代谢综合征的发生相关。纵向观察显示，深牙周袋患者有更高几率出现代谢综合征临床症状[21]。维持良好的口腔卫生有助于降低罹患代谢综合征的风险[22]。因此，探讨代谢综合征与牙周疾病关系的机制具有临床价值。

糖脂代谢紊乱是代谢综合征的重要临床特征，表现为高糖高脂血症[7]。高血脂最常见类型是总甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平升高，伴高密度脂蛋白胆固醇水平下降[23]，其中引起细胞毒性的脂质有甘油三酯、游离胆固醇、游离脂肪酸等。代谢综合征患者静脉血游离脂肪酸浓度为(0.40±0.10)mM[24]，棕榈酸属于游离饱和脂肪酸，体外实验常用0.4mM棕榈酸作为高脂培养条件[15,16,25]。Ying等发现0.4mM棕榈酸作用心肌细胞24h后细胞增殖活性受抑制，凋亡率上升[25]。临床上暂无文献报道龈沟液中游离脂肪酸的浓度，但有学者发现龈沟液中可检测到载脂蛋白B，其浓度约为静脉血的25倍[26]，载脂蛋白B是低密度脂蛋白胆固醇的主要结构蛋白，它的测定可直接反应低密度脂蛋白胆固醇的水平。研究表明，龈沟探诊出血及指尖采血的血糖浓度在个体内均有高度相关性，提示口腔微环境与全血血糖浓度相近[27]。体外实验构建高糖细胞模型时常采用11mM-30mM糖浓度，研究高糖环境对血管内皮细胞、胰岛β细胞、成骨细胞等的作用[12,17,18,28,29]。Sidarala等发现20.0mM葡萄糖可激活胰岛β细胞线粒体凋亡通路[28]。

我们发现20.0mM葡萄糖及0.4mM棕榈酸培养成骨细胞24h时，细胞开始出现皱缩、脱落，胞间间隙增宽，此时细胞增殖活性较同时刻对照组降低(F24h=24.489，P=0.001)，凋亡率上升至对照组的5倍(F=6.274，P=0.022)，且高糖高脂对成骨细胞增殖的抑制及凋亡的促进呈时间依赖性。高糖高脂可影响细胞多种生物学特性，如增殖、凋亡、细胞形态等。胰岛β细胞在高糖高脂作用下，细胞周期抑制剂p16、p18表达增加，阻碍D-cyclins调控作用，细胞增殖能力下降[15]；且高糖高脂可促进胰岛β细胞释放ATP，ATP在胞外降解为ADP并与嘌呤能受体P2Y13结合，活化caspase-3，诱导细胞凋亡[30]。Caspase-3是凋亡通路中关键蛋白，经上游蛋白酶剪切为cleaved caspase-3活化，可降解细胞骨架蛋白、核蛋白等，引起细胞形态学变化，还可降解MEK激酶、PKA2促进凋亡[31]。我们实验结果显示，高糖高脂处理成骨细胞24h后，cleaved caspase-3蛋白水平显著增高，且相对表达量呈时间依赖性上调，与凋亡吻合。Pacios等在大鼠实验性牙周炎模型中发现，成骨细胞凋亡增加导致新骨形成减少，使用半胱天冬酶-3(caspase-3)抑制剂可减少成骨细胞凋亡、促进新骨形成，说明cleaved caspase-3参与成骨细胞的凋亡过程[11]。

综合我们实验结果及前人研究，显示高糖高脂从多个方面影响骨组织的改建，表现为：①高糖高脂呈时间依赖性抑制成骨细胞增殖，促进凋亡，引起细胞数量减少；②成骨细胞在高糖高脂环境中碱性磷酸酶活性下降，Runx2、COL1α的mRNA及蛋白水平下调，矿化结节数量减少，成骨能力减弱[8,9]；③高糖或高脂可增强破骨细胞骨吸收水平[10]。综上，高糖高脂通过减少成骨细胞数量、削弱成骨分化能力、提高破骨吸收水平，打破骨形成与吸收的平衡状态，影响牙槽骨的修复重建，可能是代谢综合征加重牙周炎症的原因之一。探讨高糖高脂环境下保护成骨细胞的有效方法，并促进成骨分化及抑制破骨细胞骨吸收，对临床治疗牙周炎有重要意义。

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