高糖高脂抑制成骨细胞增殖及促进凋亡*

2018-05-04 09:03邱绮虹杨骥锋
中华老年口腔医学杂志 2018年2期
关键词:高脂高糖成骨细胞

吴 娟 邱绮虹 杨骥锋 梁 敏

慢性牙周炎是口腔科常见疾病之一,牙槽骨破坏是其重要病理特征,最终导致牙松动、脱落。局部菌斑微生物是牙周炎的始动因子,而全身性因素如糖尿病、代谢综合征等系统疾病可促进牙周炎发展[1,2]。近年来研究表明,代谢综合征可加重牙周炎症状,增加失牙风险[3-6]。代谢综合征以腹型肥胖、高血压及糖脂代谢紊乱为特征,糖脂代谢紊乱常诱发高血糖高血脂[7]。Gong等发现高糖高脂通过抑制成骨分化相关基因的表达,削弱成骨细胞分化能力[8,9],并增强破骨细胞骨吸收水平[10]。健康牙周状况下,成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收处于平衡状态,维持牙槽骨的正常形态与功能。在实验性牙周炎动物模型中,成骨细胞凋亡增多导致新骨形成减少,影响牙槽骨的修复重建,加重牙槽骨缺失及牙周炎病情[11]。高糖高脂条件下,胰岛β细胞、心肌细胞及血管内皮细胞增殖活性下降,凋亡增加[12-15],但鲜有文献报道,高糖高脂是否影响成骨细胞增殖及凋亡。我们前期实验发现,高糖高脂引起成骨细胞正常形态的改变,在此基础上进一步研究高糖高脂对成骨细胞增殖及凋亡的影响,为探讨代谢综合征促进牙周炎症加重的可能原因提供新思路。

1.材料与方法

1.1 实验材料 棕榈酸(PA)粉末(MPBiomedicals,美国),D-葡萄糖(Sigma,美国),小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14,中国科学院细胞库提供),胎牛血清(Gibco,美国),青霉素链霉素双抗(Gibco,美国),α-MEM培养基(含D-glucose5.6mM,Gibco,美国),CCK-8(Dojindo,日本),Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(Biosciences,美国),RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、小鼠β-actin一抗及氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(上海碧云天),小鼠cleaved caspase-3、caspase-3一抗(Cell Signaling Technology,美国)。

1.2 高糖高脂溶液的配置 根据文献报道,研究者通常采用11mM-30mM糖浓度及或0.4mM棕榈酸处理肝细胞、巨噬细胞、肝癌细胞等,构建代谢综合征高糖高脂细胞模型[16-19]。称量棕榈酸(PA)粉末及NaOH共同溶于双蒸水,使NaOH终浓度为0.01M,棕榈酸终浓度为20.0mM,混匀后于70℃水浴30min得到PA/NaOH溶液。配置30%BSA溶液(w/v,溶于PBS),按照BSA溶液和PA/NaOH溶液的体积比为33∶40混合得到PA/BSA的稳定储备液,存放于-20℃[20]。使用时,每2ml完全培养基加入5.2mg的D-glucose及73uL的PA/BSA储存液,0.22μm滤器除菌,最终得到D-glucose 20.0mM,PA 0.4mM,BSA 0.5%的高糖高脂溶液。

1.3 细胞培养 成骨细胞MC3T3-E1在含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗的α-MEM培养基中于5%CO2、37℃条件下培养,待细胞生长至80%-90%融合后传代进行实验。细胞培养分为两组:实验组使用含D-glucose 20.0mM,PA 0.4mM,BSA 0.5%的高糖高脂溶液,对照组使用含0.5%BSA的完全培养基(含D-glucose5.6mM)。

1.4 细胞形态观察 实验组(D-glucose 20.0mM,PA 0.4mM,BSA 0.5%)及对照组(D-glucose 5.6mM,BSA 0.5%)细胞培养24h、36h、48h后,分别在倒置相差显微镜(Axiovert 40,美国)下观察细胞形态学变化。

1.5 CCK-8检测细胞增殖 成骨细胞以1500个/孔接种至96孔板,培养24h后加入完全培养基或高糖高脂溶液处理0、12、24、36、48h,每组设5个复孔,每孔100ul培养基。将培养基和CCK-8按照体积比9∶1混合,去除处理液后每孔加入CCK-8混合液100uL,37℃避光孵育2h,450nm波长下检测吸光度值。实验独立重复3次。

1.6 Annexin V/PI双染流式检测细胞凋亡 成骨细胞以2×105个/瓶接种于25cm2培养瓶,每瓶3ml培养基,培养36h后高糖高脂(D-glucose 20.0mM,PA 0.4mM,BSA 0.5%)处理细胞 0、24、30、36h,依据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书,收集细胞,用1×Binding Buffer重悬调整细胞浓度至1×109/L,加入Annexin V和PI染液室温避光孵育15 min,流式细胞仪检测,凋亡率=C4早期凋亡细胞率+C2晚期凋亡细胞率。实验独立重复3次。

1.7 Western blotting检测cleaved caspase3和caspase-3的表达 成骨细胞以2×105个/瓶接种于25cm2培养瓶,每瓶3ml培养基,培养36h后高糖高脂(D-glucose 20mM,PA 0.4mM,BSA 0.5%)处理细胞 0、6、12、24、36h,RIPA 裂解液提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒检测样本蛋白浓度,按照每泳道35ug总蛋白,10%SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白,转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,4℃孵育小鼠 cleaved caspase-3、caspase-3(1∶1000)及小鼠β-actin一抗(1∶1000)16至18h,常温孵育氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(1∶1000)1h,Image Auant Las4000mini超灵敏化学发光成像仪(GE Healthcare,瑞典)检测,Image J软件(美国国立卫生研究院)进行条带灰度值检测与分析。目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值,其中β-actin为内参。实验独立重复3次。

1.8 统计学分析 采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析,统计数据采用均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(one w ay ANOVA),LSD法进行两两比较,以双侧p<0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1 高糖高脂引起成骨细胞形态改变 倒置相差显微镜下观察,对照组成骨细胞轮廓清晰,呈梭形或多角形,细胞间呈铺路石样紧密连接(图1A-图1C)。高糖高脂培养24h时观察到细胞变得稀疏,形态皱缩,胞间间隙增宽,且随培养时间延长,该现象更加明显(图1D-图1F),提示高糖高脂可改变成骨细胞正常形态。

2.2 高糖高脂抑制成骨细胞增殖 图2所示,培养成骨细胞0、12、24、36、48h,CCK-8检测发现对照组细胞呈指数式增殖,高糖高脂组24h时吸光度值(0.065±0.013)较同时刻对照组(0.237±0.048)降低,差异有统计学意义(F24h=24.489,P=0.001),36、48h分别降低至0.032±0.022和0.027±0.022,与同时刻对照组相比差异更显著(F36h=124.319,p<0.001;F48h=272.440,p<0.001),提示高糖高脂呈时间依赖性抑制细胞增殖。

图1 高糖高脂处理24、36、48h后成骨细胞的形态变化

图2 高糖高脂处理成骨细胞0-48h后的增殖活性

2.3 高糖高脂促进成骨细胞凋亡 高糖高脂处理成骨细胞0、24、30、36h后,Annexin V/PI双染流式检测细胞凋亡,凋亡率=C4早期凋亡细胞率+C2晚期凋亡细胞率(图3A)。图3B所示,高糖高脂组24h时凋亡率(9.68%±3.33%)与对照组(1.96%±1.32%)相比差异有统计学意义(F=6.274,P=0.022),36h时凋亡率(12.89%±3.40%)上升至对照组6.6倍(P=0.004),提示高糖高脂呈时间依赖性促进成骨细胞凋亡。

图3 高糖高脂培养0-36h后成骨细胞凋亡情况

2.4 高糖高脂上调cleaved caspase-3蛋白水平 Western blotting结果显示,健康成骨细胞表达caspase-3,在相对分子量为35k Da处可见清晰条带,但极少表达活化的cleaved caspase-3;高糖高脂时间依赖性上调cleaved caspase-3蛋白水平,在17k Da处可见逐渐增强的条带,caspase-3蛋白水平不变(图4A)。图4B所示,高糖高脂处理成骨细胞24h后,cleaved caspase-3相对表达量(0.349±0.068)较对照组(0.146±0.033)升高约2.4倍(F=9.603,P=0.016),36h时蛋白水平(0.468±0.136)约为对照组的3.2倍,差异更显著(F=9.603,P=0.001),提示高糖高脂呈时间依赖性上调cleaved caspase-3表达,与细胞凋亡相呼应。

图4 高糖高脂处理成骨细胞0-36h后caspase-3、cleaved caspase-3蛋白水平

3.讨论

大量研究表明,代谢综合征与牙周炎相互影响。Iwasaki等发现,代谢综合征可增加牙周炎的发病风险[5]。高密度脂蛋白胆固醇降低、空腹血糖升高及腹部肥胖这三项危险因素与牙周疾病密切相关,牙周炎患者合并有代谢综合征时,牙周袋加深,附着丧失加重[3]。同时,牙周健康状况与代谢综合征的发生相关。纵向观察显示,深牙周袋患者有更高几率出现代谢综合征临床症状[21]。维持良好的口腔卫生有助于降低罹患代谢综合征的风险[22]。因此,探讨代谢综合征与牙周疾病关系的机制具有临床价值。

糖脂代谢紊乱是代谢综合征的重要临床特征,表现为高糖高脂血症[7]。高血脂最常见类型是总甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平升高,伴高密度脂蛋白胆固醇水平下降[23],其中引起细胞毒性的脂质有甘油三酯、游离胆固醇、游离脂肪酸等。代谢综合征患者静脉血游离脂肪酸浓度为(0.40±0.10)mM[24],棕榈酸属于游离饱和脂肪酸,体外实验常用0.4mM棕榈酸作为高脂培养条件[15,16,25]。Ying等发现0.4mM棕榈酸作用心肌细胞24h后细胞增殖活性受抑制,凋亡率上升[25]。临床上暂无文献报道龈沟液中游离脂肪酸的浓度,但有学者发现龈沟液中可检测到载脂蛋白B,其浓度约为静脉血的25倍[26],载脂蛋白B是低密度脂蛋白胆固醇的主要结构蛋白,它的测定可直接反应低密度脂蛋白胆固醇的水平。研究表明,龈沟探诊出血及指尖采血的血糖浓度在个体内均有高度相关性,提示口腔微环境与全血血糖浓度相近[27]。体外实验构建高糖细胞模型时常采用11mM-30mM糖浓度,研究高糖环境对血管内皮细胞、胰岛β细胞、成骨细胞等的作用[12,17,18,28,29]。Sidarala等发现20.0mM葡萄糖可激活胰岛β细胞线粒体凋亡通路[28]。

我们发现20.0mM葡萄糖及0.4mM棕榈酸培养成骨细胞24h时,细胞开始出现皱缩、脱落,胞间间隙增宽,此时细胞增殖活性较同时刻对照组降低(F24h=24.489,P=0.001),凋亡率上升至对照组的5倍(F=6.274,P=0.022),且高糖高脂对成骨细胞增殖的抑制及凋亡的促进呈时间依赖性。高糖高脂可影响细胞多种生物学特性,如增殖、凋亡、细胞形态等。胰岛β细胞在高糖高脂作用下,细胞周期抑制剂p16、p18表达增加,阻碍D-cyclins调控作用,细胞增殖能力下降[15];且高糖高脂可促进胰岛β细胞释放ATP,ATP在胞外降解为ADP并与嘌呤能受体P2Y13结合,活化caspase-3,诱导细胞凋亡[30]。Caspase-3是凋亡通路中关键蛋白,经上游蛋白酶剪切为cleaved caspase-3活化,可降解细胞骨架蛋白、核蛋白等,引起细胞形态学变化,还可降解MEK激酶、PKA2促进凋亡[31]。我们实验结果显示,高糖高脂处理成骨细胞24h后,cleaved caspase-3蛋白水平显著增高,且相对表达量呈时间依赖性上调,与凋亡吻合。Pacios等在大鼠实验性牙周炎模型中发现,成骨细胞凋亡增加导致新骨形成减少,使用半胱天冬酶-3(caspase-3)抑制剂可减少成骨细胞凋亡、促进新骨形成,说明cleaved caspase-3参与成骨细胞的凋亡过程[11]。

综合我们实验结果及前人研究,显示高糖高脂从多个方面影响骨组织的改建,表现为:①高糖高脂呈时间依赖性抑制成骨细胞增殖,促进凋亡,引起细胞数量减少;②成骨细胞在高糖高脂环境中碱性磷酸酶活性下降,Runx2、COL1α的mRNA及蛋白水平下调,矿化结节数量减少,成骨能力减弱[8,9];③高糖或高脂可增强破骨细胞骨吸收水平[10]。综上,高糖高脂通过减少成骨细胞数量、削弱成骨分化能力、提高破骨吸收水平,打破骨形成与吸收的平衡状态,影响牙槽骨的修复重建,可能是代谢综合征加重牙周炎症的原因之一。探讨高糖高脂环境下保护成骨细胞的有效方法,并促进成骨分化及抑制破骨细胞骨吸收,对临床治疗牙周炎有重要意义。

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