芝麻香型丢糟酒生产过程中糖化酶应用

宗绪岩,王祥余,李 丽,刘 杰,廖华桥

(1.四川理工学院,四川自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;3.青岛根源生物技术集团有限公司,山东青岛 266000;4.日出东方太阳能股份有限公司检测中心,江苏连云港 222005)

在我国传统的固态白酒发酵过程中丢糟是一种主要的副产物,据统计其每年产量高达2500 万吨,而且这些丢糟成分复杂,容易腐坏造成环境污染,处理十分困难[1-3]。在众多香型白酒的丢糟中,芝麻香型白酒的丢糟淀粉含量整体较高(10%～12%),富含发酵过程中残留的各种香气物质[4-6]。

目前针对白酒生产的酶制剂研究已经有很多[7-10],本文利用已建立的芝麻香型丢糟酒实验室生产模型预测各种糖化酶的使用效果,同时在相应酒厂的生产线上同步进行实验,考察不同糖化酶对芝麻香型丢糟酒生产的实际影响,同时考察该模型的预测效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丢糟 山东地区某著名酒厂丢糟,丢糟前期发酵工艺为传统芝麻香发酵工艺,使用窖池为砖垒花洞塞泥窖;酵母菌 安琪酵母股份有限公司生产;液体糖化酶(E1) 安琪酵母股份有限公司生产,15万U/g;固体糖化酶(E2) 江苏博力生物制品有限公司,8万U/g;液体复合糖化酶(E3) 青岛根源生物集团生产,18万U/g;酒石酸钾钠(分析纯) Aladdin®;五水硫酸铜、NaOH 分析纯,MERCK;葡萄糖、麦芽糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油、琥珀酸、三糖、四糖、五糖、多糖、淀粉分解糊精、双乙酰、甲醇、乙醇、NaOH等 均为色谱纯,Sigma公司。

ME3002天平、万分之一天平 Mettler;Waters 1515高效液相色谱(配备Waters 2414 Refractive Index Detector、Waters 2707 Autosampler、Aminex® HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm色谱柱) Bio-Rad生产;Milli-Q纯水机 Merck;样品制备仪 SPEX® Sample Prep 1600;水浴锅 Heto;烘箱 BINDER;摇床 Innova® 44;其余玻璃器皿 德国Duran。

1.2 实验方法

1.2.1 实验室丢糟酒发酵 参照文献[11],稍有改进。使用1 L发酵瓶,每个发酵瓶中加入新鲜丢糟酒醅600 g,0.12 g安琪高活性酵母(使用前用32 ℃去离子水5 mL活化15 min),酶制剂使用剂量为糖化酶酶活17 U/g丢糟酒醅,充分混匀,E1、E2和E3分别做5个平行样;封口前用75%酒精将发酵瓶口部及酒糟没有接触到的发酵瓶上部消毒,用保鲜膜封口置于环境温度为22 ℃培养箱中避光发酵30 d。以大生产入窖丢槽酒醅为对照(CK)。

1.2.2 工厂芝麻香型丢糟酒发酵 在正常生产芝麻香型白酒的成熟酒醅完成蒸酒后,待酒醅温度低于35 ℃时按照糖化酶酶活17 U/g丢糟酒醅分别加入E1、E2和E3以及0.2 kg/t安琪高活性酵母(提前活化),并混匀,每种酶制剂分别做5 个窖池,入砖垒花洞塞泥窖密封发酵30 d。以大生产入窖丢槽酒醅为对照(CK)。

1.2.3 样品处理 实验室样品:为保证实验室数据的准确性,在实验室中需将发酵瓶中的发酵物全部转移到密封袋中,仔细混匀后方可取样;取得的样品主要进行残淀粉测定和成熟酒醅成分测定。关于实验室入窖酒醅的残淀粉测定也需遵循混匀后取样的原则。

工厂样品:为保证工厂数据的准确性,在工厂中需对每一甑的样品进行取样,取样点分为中央和四周五个点,共计每个窖池需取样30个,混匀后取1 kg作为样品带回实验室分析。将各样品分别用10倍质量、100倍质量的超纯水混合振荡后离心,上清液过0.45 μm滤膜后备用。

1.2.4 残淀粉检测 残淀粉的检测方法为酶法,原理与Megazyme试剂盒一致,利用诺维信复合淀粉酶和糖化酶代替Megazyme所用酶制剂以取得更稳定的检测结果。

残淀粉含量(%)=酶解液中还原糖量/样品量×100

1.2.5 成熟酒醅成分检测 成熟酒醅的成分检测使用Waters 1515高效液相色谱,柱温为65 ℃,流动相为5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,分析时间为30 min。将标准品配制成不同浓度的单标溶液,分别进样确定出峰时间和峰面积与浓度关系,然后将样品提取液分别进样分析,计算出酒精、葡萄糖、乳酸、醋酸含量。

1.2.6 原酒香气物质检测 使用GC-MS检测原酒中的香气物质,第三方机构负责检测,检测方法见参考文献[12]。

1.2.7 感观分析 参考国家标准GB/T 33404-2016《白酒感官品评导则》和GB/T 33405-2016《白酒感官品评术语》。实验采用暗酒明评方式,选择5位省级以上专业品评员,将酒样分为3轮随机呈送,酒杯采用标准白酒品酒杯,每杯倒酒约20 mL,经品评后集体讨论,给出描述性语言定性评价结果。通过感官定量描述分析方法对产品特征进行品评,特征定性表达可参考白酒感官特征描述语库,选择合适词汇描述酒样中的感官特征,或者选择未涉及的其他特征描述语定性。

1.2.8 酶制剂电泳检测 固体的E2进行酶制剂电泳检测,方法是使用pH4.6的醋酸-醋酸钠溶液以1∶10溶解并稀释酶制剂,在层析柜中用磁力搅拌器于4 ℃搅拌2 h,最后在4 ℃以4000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm微晶纤维素膜备用;液体的E1和E3则需用pH为4.6的醋酸-醋酸钠溶液以1∶10稀释,按照处理E2的方法处理即可。电泳的具体方法参见文献[13]。

1.2.9 数据处理 采用Excel作图。采用SPSS V17.0软件,对实验结果进行统计分析,统计方法采用ANOVA(方差分析)进行各实验组间的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 发酵成熟酒醅残淀粉分析

采用酶法测定实验室及出窖酒醅样品中的淀粉含量,结果分析如图1所示。

图1 不同生产条件下成熟酒醅的残淀粉含量Fig.1 Residual starch of pit-outwaste lees by different production conditions注:不同小写拉丁字母和不同小写希腊字母分别代表大生产和小试结果差异显著(p<0.05),图2～图5同。

从图1的结果可以看出,E1、E2和E3在生产和实验室条件下出窖酒醅残淀粉与入窖酒醅残淀粉(CK)含量具有显著差异(p<0.05),且大生产条件下和实验室模拟的结果是一致的,即残淀粉最低的是E3,大生产时为3.26%,实验室条件为3.62%,其次是E1,大生产时为3.90%,实验室条件为4.24%,残淀粉含量最高的是E2,大生产时为4.01%,实验室条件为4.28%,且残淀粉含量均低于入窖酒醅中残淀粉含量(CK)4.82%。上述结果表明:实验室模型能够预测出不同酶制剂在大生产条件下出窖酒糟残淀粉方面表现的优劣。复合型糖化酶E3在发酵中表现明显优于普通的糖化酶。固体糖化酶在表现上与液体糖化酶无显著差异。实验室条件下标准差比大生产条件低,表明实验室模型的稳定性明显高于大生产条件。

2.2 发酵成熟酒醅酒精含量分析

采用HPLC法测定实验室及大生产出窖后酒醅样品中的酒精含量,结果分析如图2所示。

图2 不同生产条件下成熟酒醅的酒精含量Fig.2 Alcohol yield in pit-out waste lees by different production conditions

从图2的结果可以看出,由于实验室混匀更加充分,因此成熟酒醅的酒精含量也更高,使用E1、E2和E3的小试成熟酒醅中酒精含量分别达到了2.01%、1.99%和2.45%,远高于大生产样品中酒精含量0.76%、0.83%和1.04%,同文献[11]结果相一致。复合糖化酶E3在成熟酒醅酒精含量方面明显高于其他两种糖化酶E1和E2。比较大生产条件与实验室条件下成熟酒醅酒精含量的标准差,得到的结论与残淀粉的表现一致,即实验室模型较大生产具有更高的稳定性。结合成熟酒醅残淀粉和成熟酒醅酒精含量可知复合酶E3相对于E1和E2多分解的残淀粉有一定数量是被微生物转化为酒精,从而提高了成熟酒醅的酒精含量,另外不同条件和酶制剂作用下成熟酒醅的残淀粉和酒精含量的不同也与残淀粉分解转化为酒精的代谢路径相吻合[11]。

2.3 发酵成熟酒培残糖含量分析

采用HPLC法测定实验室及大生产出窖后酒醅样品中的残糖含量,结果分析如图3所示。

图3 不同生产条件下成熟酒醅的残糖含量Fig.3 Residual glucose in pit-out waste lees by different production conditions

从图3数据可以看出,对比相同条件下不同酶制剂的结果,大生产条件下E3成熟酒醅残糖含量最低为2.07%,E2与E1残糖含量差异显著(p<0.05),分别为2.56%和2.46%,均高于入窖时残糖含量1.28%;在实验室条件下情况有所区别,残糖含量分别为0.25%、0.26%和0.28%,均低于入窖时残糖含量1.28%,但是三种酶制剂成熟酒醅的残糖含量之间无显著性差异;对比不同条件下相同酶制剂的残糖含量可知,大生产条件下的成熟酒醅残糖含量比实验室条件下均高出近10倍,大生产条件下残糖的含量明显偏高的现象表明在大生产条件下能够利用和消耗葡萄糖的微生物特别是酵母菌的数量及其活性是明显不足的,这种不足既来源于酵母的活化工艺不足,也来源于物料的混合均匀度[3]。

结合本文残淀粉的结论可知,酶制剂的不同虽然使得成熟酒醅残淀粉的含量有所不同,但对这些残淀粉来说即使所有残淀粉的最大差距(E3:3.71%-3.26%=0.45%,转化为葡萄糖的含量应该低于0.5%)均转化为葡萄糖且这些葡萄糖均得以残留到成熟酒醅中也不能造成多达2%的残葡萄糖的差异,证明成熟酒醅中的残葡萄糖含量不可能仅仅受到残淀粉分解量高低的影响,更受到发酵过程中葡萄糖被微生物的分解利用的限制,同时大生产条件下三种酶制剂的残葡萄糖含量均远高于成熟酒醅残淀粉差异所能造成的残葡萄糖含量差异,进一步证明了这种限制在大生产条件下的普遍性。

结合成熟酒醅酒精含量的分析可知,如果大生产成熟酒醅中的残葡萄糖含量均以最大的转化效率(酵母厌氧呼吸条件下葡萄糖转化为酒精的转化率为51.1%)转化为酒精,则大生产条件下E1、E2和E3可多得的酒分别是1.31%、1.26%、1.06%,加上已经存在的出酒率,理论最高可分别达到2.07%、2.09%、2.10%,与实验室条件下所得的成熟酒醅酒精含量2.04%、1.99%和2.45%较为接近。综上所述,提高成熟酒醅酒精含量的关键仍是设法减少成熟酒醅中的残糖含量。

2.4 发酵成熟酒醅乳酸含量的分析

采用HPLC法测定实验室和大生产出窖后成熟酒醅样品中的乳酸含量,结果分析如图4所示。

图4 不同生产条件下成熟酒醅的乳酸含量Fig.4 Lactic acid in pit-out waste lees by different production conditions

从图4结果可以看出,大生产条件下E1、E2和E3成熟酒醅同入窖酒醅乳酸含量存在差异,分别为4.08%、3.74%、3.63%和3.74%,而CK、E2和E3的差异不显著(p>0.05);E1乳酸含量最高,与仅次于它的CK存在一定差异。

在实验室条件下E1、E2和E3成熟酒醅乳酸含量差异均不显著(p>0.05),同入窖酒醅乳酸含量有差异,分别为3.22%、3.32%、3.19%和3.74%。比较不同条件下相同酶的乳酸积累差距,结果表明在大生产条件下的乳酸含量均高于实验室条件,证明发酵环境的乳酸菌数量对发酵成熟酒醅中的乳酸积累有着明显的影响。这也可能是大生产条件下葡萄糖积累的原因之一,乳酸含量的增加抑制了部分微生物,尤其是产乙醇的酵母的活性,造成其发酵变弱,类似的结果在文献[14-15]中也有报道。

2.5 发酵成熟酒醅醋酸含量的分析

采用HPLC法测定大生产和实验室出窖后酒醅样品中的醋酸含量,结果分析如图5所示。

图5 不同生产条件下成熟酒醅的醋酸含量Fig.5 Acetic acid in pit-out waste lees by different production conditions

如图5所示,大生产和实验室条件下E1、E2和E3成熟酒醅醋酸含量及入窖酒醅醋酸含量均无显著差异(p>0.05),大生产分别为0.47%、0.41%、0.41%和0.41%,小试分别为0.32%、0.38%、0.40%和0.41%。比较不同条件下相同酶制剂的成熟酒醅醋酸含量,结果显示醋酸含量无统计学差异(p>0.05),证明发酵环境的醋酸菌数量及发酵过程中醋酸的积累无影响,远不如乳酸菌的影响明显,与文献[16]的结论相吻合。

2.6 大生产发酵原酒检测

如表1所示,根据GC-MS结果,将大生产条件下酯类物质、醇类物质和酸类物质的比例同标准的芝麻香型白酒酯类物质(乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的比例为1∶0.9∶0.3∶0.1)、醇类物质(正丙醇、异戊醇、异丁醇和正丁醇的比例为1∶0.7∶0.3∶0.2)和酸类物质(乙酸、乳酸、己酸和丁酸的比例为1∶0.4∶0.2∶0.1)合理比例[17]进行比较可知:酯类物质E2最接近于合理比例,其次是E3,最后是E1;醇类和酸类物质E2与E3较好,E1较差。

表1 大生产实验原酒的气质联用检测结果(mg/L)Table 1 GC-MS results of original liquor of distillery experiments(mg/L)

在原酒口感上,经过专业品酒师感官评价得出结论:E1香气带有淡淡的泥香,酒体清雅淡爽,后尾味短淡,风格与芝麻香型丢糟酒相比有所改变;E2香气带有愉快的焦香,味醇甜爽口,后味焦味较好;E3香气带有愉快的焦香,味醇甜爽口,后味焦味较好,尾比E2稍淡。结合发酵成熟酒醅酒精含量分析的结论可知E3生产原酒比E2味道清淡的原因应该是发酵过程中成熟酒醅中酒精含量明显高于E2,高出约25%,稀释了成熟酒醅中的香气物质所致。

2.7 酶制剂电泳检测

如图6所示,对E1、E2和E3进行电泳检测,发现E1条带最为简单,E3最复杂,明显有多出的条带,E2则与E1类似。结合发酵的结果,可以推测E3中多出的条带可能对丢糟中残淀粉的高效利用有促进作用,但需进一步的研究。

图6 酶制剂电泳检测结果Fig.6 Electrophoresis result of enzyme

3 结论与讨论

通过三种糖化酶(液体糖化酶E1，固体糖化酶E2，液体复合糖化酶E3)在大生产条件和实验室模型中应用，对比了入窖酒醅同两种条件下成熟酒醅的残淀粉量、酒精含量、残糖含量以及乳酸和醋酸的含量，并对酒醅进行了色谱分析和感官分析。E3残淀粉含量最低；E1、E2和E3的小试成熟酒醅中酒精含量远高于大生产，E3在成熟酒醅酒精含量方面明显高于其他两种糖化酶；大生产条件和实验室模型E3成熟酒醅残糖含量最低，优于E1同E2，均低于入窖时残糖含量；大生产和实验室条件下E1，E2和E3成熟酒醅乳酸含量及入窖酒醅乳酸含量差异不大(p<0.05)；大生产和实验室条件下E1，E2和E3成熟酒醅醋酸含量及入窖酒醅醋酸含量均无显著性差异(p<0.05)；酯类物质含量E2最接近于合理比例，其次是E3，最后是E1；醇类和酸类物质E2与E3较好，E1较差。对三种酶进行电泳分析可以得出E3多出的条带可能与E3对丢糟中残淀粉的高效利用有关。综合分析，液体复合糖化酶E3效果最好 ，优于固体糖化酶E2和液体糖化酶E1。

芝麻香型丢糟酒实验室生产模型可以预测实际工厂生产过程中成熟酒醅的残淀粉、出酒率、残葡萄糖等关键指标,为筛选合适的发酵剂提供方便;在实际工厂的生产中物料的混匀度对成熟酒醅中出酒率、残淀粉有着显著影响,同时微生物的活性特别是酵母的活化效果对成熟酒醅出酒率及残葡萄糖含量有着更显著影响;复合酶制剂对丢糟酒出酒率和口感均存在显著影响,确定复合酶制剂中对丢糟酒生产有利的酶分子对提高丢糟酒产量和质量有着一定的科研和应用价值。

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