乳苣不同溶剂提取物对α-淀粉酶的抑制作用及光谱研究

高义霞,陶超楠,郑 婷,朱玉芳,周向军，*

(1.天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水 741001;2.甘肃省大樱桃工程技术研究中心,甘肃天水 741001)

α-淀粉酶是一种随机水解α-1,4糖苷键的Ca2+依赖性内切淀粉酶,其催化淀粉转化生成少量葡萄糖和糊精,已广泛用于食品、化工等行业中。目前,国内外有关α-淀粉酶的研究,主要集中在其高产菌筛选和鉴定、基因重组、表达及其抑制剂等方面[1-6]。α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷酶抑制剂,可有效抑制消化道内淀粉酶活性,阻止食物糖类的水解和吸收,降低人体血糖含量,抑制脂肪合成,临床上常用于糖尿病、肥胖症、高血糖和高血脂等疾病预防[7-8]。

乳苣(MulgediumtataricumL.)，又名蒙山莴苣、紫花山莴苣及苦菜等,为菊科乳苣属药食两用草本植物。乳苣全草可药用,主要化学成分为倍半萜和三萜类化合物[9],具有抗菌、抗癌及消炎等作用[10-12]。山楂叶、白芸豆等活性成分对α-淀粉酶具有一定抑制作用[13-14],但有关乳苣中α-淀粉酶抑制剂的研究还未见报道。研究不同溶剂乳苣提取物对α-淀粉酶的抑制作用、动力学及作用机制等,不仅有助于从不同角度探讨酶结构与功能的关系,且为寻找天然、安全降糖药物提供重要的科学依据。

本实验以乳苣全草为材料,α-淀粉酶为研究对象,研究水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物对α-淀粉酶的抑制作用、类型、动力学参数、紫外光谱和表面疏水性等影响,旨在为糖尿病、肥胖症和高血脂等疾病预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

乳苣(MulgediumtataricumL.) 甘肃省白银市靖远县农田和水渠边,经鉴定为菊科乳苣属乳苣。乳苣全草,室温风干,粉碎,过80目筛备用；α-淀粉酶(58.7 U/mg)、8-苯胺-1-萘磺酸(>97%纯度) Sigma产品;可溶性淀粉、磷酸氢二钾、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠和亚硫酸氢钠 国产分析纯；3,5-二硝基水杨酸(DNS) 甲液:6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液,蒸馏水稀释至69 mL,再加入6.9 g亚硫酸氢钠；乙液:225 g酒石酸钾钠溶于300 mL 10% NaOH溶液,再加入880 mL 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液，混合甲乙溶液,棕色瓶放置一周后使用；0.05 mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液:七水合磷酸氢二钠3.35 g,二水合磷酸二氢钠1.95 g,450 mL蒸馏水溶解,调pH6.8,蒸馏水定容至500 mL。

UV1800型紫外可见分光光度计、RF-5301PC型荧光分光光度计 日本岛津;AL204精密分析天平 瑞士梅特勒;电热恒温水浴锅:上海精宏实验设备有限公司;雷磁PHS-3D型pH计 上海精密科学有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1α-淀粉酶反应进程曲线制作 采用Bernfeld法[15],稍作修改。取11.4 mL 0.05 mol/L pH6.8磷酸缓冲液于50 mL三角瓶中,加入0.6 mL 0.5 mg/mLα-淀粉酶液,充分混匀,50 ℃水浴20 min。加入3.0 mL 1%可溶性淀粉(预先经50 ℃水浴)作为底物,混匀计时。酶促进程曲线制作：前5 min每隔30 s,后5 min每隔1 min,取0.5 mL酶解液沸水灭活3 min,加入DNS试剂1.0 mL,沸水5 min,加水补至5.0 mL后540 nm测吸光值,制作酶促进程曲线,确定线性时间。

1.2.2 乳苣提取物制备及其对α-淀粉酶的抑制作用 乳苣的水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物制备参考高义霞等方法[16]。取0.05 mol/L pH6.8磷酸缓冲液3.8 mL,加入0.5 mg/mLα-淀粉酶0.2 mL,混匀后加入各提取物(水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物)，使其终浓度分别为0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL,充分混匀,50 ℃水浴20 min,加入50 ℃预热的1%可溶性淀粉溶液1.0 mL,1.5 min后沸水灭活,加入DNS试剂1 mL,沸水5 min,室温中冷却后,蒸馏水定补至5.0 mL,520 nm处测吸光值。以0.2 mL磷酸盐缓冲溶液代替酶液,作为空白对照。α-淀粉酶抑制率(%)=(A0-A1)/A0×100。式中:A0为未添加提取物吸光值,A1为添加提取物吸光值。

1.2.3 乳苣提取物对α-淀粉酶的抑制类型和动力学参数 取1%可溶性淀粉1.0 mL,分别测定0.0、0.5、2.0、4.0 mg/mL各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)时,α-淀粉酶活性随其浓度变化趋势,以酶含量为横坐标,吸光值为纵坐标,判断不同提取物对α-淀粉酶的抑制类型。固定α-淀粉酶浓度为0.02 mg/mL,测定可溶性淀粉浓度分别为0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL时,水和石油醚提取物对应的Ki,可溶性淀粉浓度分别为0.5、1.0和2.0 mg/mL时,正丁醇提取物对应的Kis或Ki[17-18]。

1.2.4 乳苣提取物对α-淀粉酶紫外和表面疏水性的影响 固定α-淀粉酶浓度为0.5 mg/mL,测定各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分别为0.0000、0.0125、0.0250、0.0375和0.0500 mg/mL时,作用10 min后其对α-淀粉酶紫外光谱的影响,同时作对照实验;固定ANS为8.0 mmol/L,α-淀粉酶浓度为0.5 mg/mL,各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分别为0.00、0.25、0.50和1.00 mg/mL,作用10 min。在激发波长344 nm,400～600 nm扫描,测定其对α-淀粉酶表面疏水性影响,同时作对照实验[19]。

1.3 数据处理

实验重复3次,采用SPSS 16.0中Profit分析方法计算半抑制浓度IC50,利用Origin 7.5作图。

2 结果与讨论

2.1 酶促反应进程曲线

酶活力测定,首先需确定线性反应时间,线性时间应在初速度范围内选择,而初速度对应的时间范围需通过酶促反应进程曲线来选择。进程曲线常以单位时间内产物增加量与反应时间的关系曲线表示。

反应起始阶段,曲线斜率几乎不变,但随时间延长,曲线平缓,速率降低,可能原因是底物浓度降低、产物浓度增加引起的逆反应加强、产物对酶抑制或酶本身部分失活等[20]。酶促反应进程曲线见图1。吸光值随时间延长几乎成线性增加,随后逐渐趋于平缓,产物增加量减慢。1.5 min内线性较好,相关系数达0.99以上,时间延长则线性降低,不利于后续数据拟合。因此,酶活测定时间选择1.5 min。

图1 酶促反应进程曲线Fig.1 Enzymatic reaction curve

2.2 乳苣提取物对α-淀粉酶的抑制作用

由图2可知,在0～8.0 mg/mL范围内,水、正丁醇和石油醚提取物对α-淀粉酶抑制作用均随其浓度增大而增强(p<0.05)。当提取物浓度大于2.0 mg/mL时,水、正丁醇和石油醚提取物抑制率均超过50%,大于8.0 mg/mL时,石油醚提取物抑制率接近100%。在0～2.0 mg/mL范围内,随氯仿提取物浓度增加,其对α-淀粉酶的抑制作用出现波动,在2.0～8.0 mg/mL范围内,氯仿提取物对α-淀粉酶抑制作用逐渐增强(p<0.05);在0～6.0 mg/mL范围内,乙酸乙酯提取物对α-淀粉酶几乎无抑制作用,当大于6.0 mg/mL时,抑制作用急剧增强(p<0.05);利用SPSS 16.0软件中的Profit分析方法,其中,响应频率为抑制率,协变量为抑制剂浓度[21],求得水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物对α-淀粉酶IC50分别为2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL。后续实验选择抑制作用较稳定且较强的水、正丁醇和石油醚提取物。

图2 不同乳苣提取物对α-淀粉酶抑制作用Fig.2 Inhibition effects of Mulgedium tataricum L.extracts on α-amylase

2.3 乳苣提取物对α-淀粉酶的抑制类型和动力学特征

图3、图5和图7中,C为各溶剂提取物浓度。在底物浓度和水/正丁醇提取物浓度不变条件下,体系吸光值随α-淀粉酶含量增加呈线性增加。不同水/正丁醇提取物浓度条件下,各直线几乎相交于原点,且直线斜率随提取物浓度增加而下降,表明水/正丁醇提取物对α-淀粉酶的抑制作用,不是通过降低有效酶量导致活力下降的,而是通过抑制酶活性导致催化效率降低,表现为可逆抑制作用[22];石油醚提取物对α-淀粉酶抑制作用则与此不同,以吸光值对酶含量作图,为一组平行直线,见图7。随石油醚提取物浓度不断增大,直线平行从原点向右移动,说明石油醚提取物在反应初期对酶为不可逆抑制,使酶永久失活,从而减少有效酶量。因此,石油醚提取物与α-淀粉酶间存在一定化学计量数的抑制关系,仅当酶的物质的量大于石油醚提取物时,即有过量酶分子时,才表现出活力。此时,不同抑制剂浓度条件下的反应初速度,随酶量增加表现为与对照组一样,为相互平行的直线[23]。但对照组未通过原点,可能是该体系中存在某些未知α-淀粉酶激活因素或某些激活因素占优。

图3 水提取物对α-淀粉酶抑制类型Fig.3 Inhibition type of water extract on-amylase

图5 正丁醇提取物对α-淀粉酶抑制类型Fig.5 Inhibition type of butanol extracts on α-amylase

图7 石油醚提取物对α-淀粉酶抑制类型Fig.7 Inhibition type of petroleum ether extracts on α-amylase

图4中,以1/V对1/S作图,V为反应速度,S为底物浓度。双倒数作图得到一组横轴截距不变的直线,水提取物不影响米氏常数(Km),只影响最大反应速度(Vmax),抑制类型为非竞争性抑制。这表明水提取物与α-淀粉酶活性中心外必需基团结合,且这种结合并不影响酶与底物结合,同时,底物与酶的结合,也不影响酶与水提取物的结合,两者相互独立。但由于酶-底物-水提取物不能进一步形成产物,所以不能通过增加底物浓度来降低其对酶的抑制程度[24]。以双倒数作图各斜率对水提取物浓度作图,求得Ki为1.653 mg/mL。

图4 水提物的1/V-1/S曲线Fig.4 1/V-1/S curve of water extraction

由图6可知,双倒数作图得到一组斜率不同,并交于第三象限的直线,抑制类型为线性混合抑制类型,即兼具反竞争性和非竞争性抑制。线性混合抑制作用类似于非竞争性抑制作用,酶可首先与底物或抑制剂结合,酶与底物结合不影响其与抑制剂进一步结合,反之,酶与抑制剂结合也不影响其与底物进一步结合。但线性混合型抑制中,酶与底物或抑制剂结合次序不同,则具有不同的反应常数[25]。以双倒数作图各斜率和截距分别对正丁醇提取物浓度作图,求得Ki和Kis分别为0.795和0.435 mg/mL,前者约为后者1.828倍,表明正丁醇提取物与酶-底物络合物的亲和力强于其与游离酶亲和力[26]。当底物浓度和正丁醇提取物均为4.0 mg/mL时,α-淀粉酶活性几乎被完全抑制,故图6未设置此组实验。

图6 正丁醇提取物的1/V-1/S曲线Fig.6 1/V-1/S curve of butanol

由图8可知,双倒数作图得到一组斜率不同,并几乎交于Y轴的直线,为竞争性抑制。这表明石油醚提取物可能与底物具有某些结构相似性,与底物共同竞争酶活性中心结合位点,不能与酶-底物络合物结合,主要通过诱导酶结构发生变化而使酶催化活性降低[27],属于底物型不可逆抑制,亦即邹承鲁教授提出的竞争性不可逆抑制[28-29],求得Ki为2.893 mg/mL。

图8 石油醚提取物的1/V-1/S曲线Fig.8 1/V-1/S of petroleum ether extracts

2.4 乳苣提取物对α-淀粉酶紫外光谱的影响

α-淀粉酶最大吸收波长在280 nm附近,主要由色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)侧链的光吸收引起,其波长或吸收强度变化可反映Trp和Tyr残基所处微环境的改变,故可选择紫外吸收光谱探讨α-淀粉酶结构变化。由图9～图11可知,未加α-淀粉酶时,0.05 mg/mL的水、正丁醇和石油醚提取物在280 nm均无特征吸收峰。当水、正丁醇和石油醚提取物浓度增大时,α-淀粉酶紫外吸收均逐渐增强,表明上述提取物与α-淀粉酶相互作用后,改变了Trp和Tyr等芳香族残基的微环境,从而引起α-淀粉酶吸收强度改变[30]。但α-淀粉酶紫外光谱均无明显红移或蓝移现象,这说明各提取物与α-淀粉酶相互作用,仅通过氢键、范德华力、离子键和疏水相互作用等非共价作用,轻微改变其空间构象,并不发生共价作用。

图9 水提取物紫外光谱Fig.9 Ultraviolet spectrum of water extract

图10 正丁醇提取物紫外光谱Fig.10 Ultraviolet spectrum of n-butyl alcohol extract

图11 石油醚提取物紫外光谱Fig.11 Ultraviolet spectrum of petroleum ether extract

2.5 乳苣提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响

蛋白质表面疏水性与其来源、加工方法、加工条件和溶剂有关,也与其理化性质和结构有关[31]。荧光探针ANS单独存在时,最大发射波长在510 nm附近,荧光强度极小。水提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响见图12。由图12可知,当水提取物处理时,ANS最大发射波长由510 nm迁移至470 nm附近。随水提取物浓度增大,ANS荧光强度逐渐增强,表明适宜浓度水提取物处理,可增强酶分子表面更多疏水区域暴露,诱发了α-淀粉酶的解折叠[32],从而可结合更多的ANS阴离子使荧光强度增强;正丁醇提取物对α-淀粉酶表面疏水性影响见图13。由图13可知,当正丁醇提取物处理时,ANS最大发射波长由510 nm迁移至450 nm附近。当正丁醇提取物较低(0.25 mg/mL)时,增强了荧光强度,这可能是低浓度正丁醇提取物与ANS结合,使酶分子部分伸展,导致蛋白质表面更多疏水区域暴露,从而可结合更多ANS阴离子;但当正丁醇提取物浓度较高(0.5～1.0 mg/mL)时,正丁醇提取物与ANS阴离子同时竞争结合酶分子表面,因而导致与ANS阴离子结合减弱,荧光强度下降[33];石油醚提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响见图14。由图14可知,当石油醚提取物处理时,ANS最大发射波长由510 nm迁移至490～500 nm附近。与正丁醇提取物不同,当低浓度(0.25 mg/mL)石油醚提取物处理时,其可能镶嵌于酶分子的疏水性空穴中,并通过静电相互作用部分稳定了酶分子的空间结构,相当于阻止了疏水基团暴露,因而降低了荧光强度。当高浓度(0.5～1.0 mg/mL)石油醚提取物处理时,其主要作用是使酶分子的空间结构完全伸展,疏水基团最大化暴露,因而增强了荧光强度。各提取物的荧光强度并未随溶剂极性增大而降低,即未遵循“正溶剂动力学”效应[34],原因是不同溶剂提取物的结构和性质不同,其对α-淀粉酶和ANS荧光强度的影响叶不同。另外,水提取物荧光强度明显高于正丁醇和石油醚提取物,原因是水是质子性溶剂,ANS与其形成氢键能力较强,相当于在ANS周围形成了有序的簇集体系[35],有效保护了ANS荧光发射。正丁醇虽为质子性溶剂,但质子供体能力远低于水分子,石油醚为非质子性溶剂,因此两者较为接近,且远低于水提取物荧光强度。

图12 水提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响Fig.12 Effects of water extract on surface hydrophobicity of α-amylase

图13 正丁醇提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响Fig.13 Effects of n-butyl alcohol extract on surface hydrophobicity of α-amylase

图14 石油醚提取物对α-淀粉酶表面疏水性的影响Fig.14 Effects of petroleum ether extract on surface hydrophobicity of α-amylase

3 结论与讨论

水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯对α-淀粉酶的IC50分别为2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL,其中,石油醚提取物对α-淀粉酶的抑制作用最强。由于在0～2.0 mg/mL范围内,氯仿提取物对α-淀粉酶的抑制作用出现波动,且氯仿毒性较大;在0～6.0 mg/mL范围内,乙酸乙酯提取物对α-淀粉酶几乎无抑制作用,故后续实验未考虑氯仿和乙酸乙酯提取物。由上述分析可见,乳苣的水、正丁醇和石油醚提取物是一种潜在有效的α-淀粉酶抑制剂,可通过分离纯化进一步筛选其单体,以用于糖尿病、肥胖症等疾病预防。另外,水、正丁醇、石油醚提取物均可增加α-淀粉酶的紫外吸收强度,但不改变其吸收峰位置,这主要是3种提取物均可改变α-淀粉酶空间构象,使芳香族氨基酸而分布在酶分子表面,从而增强了紫外吸收能力,但未发生共价相互作用,不破坏酶分子的一级结构;水、正丁醇、石油醚提取物均可使ANS发生蓝移,改变了其荧光发射峰位置。

本实验中,乳苣不同溶剂提取物对α-淀粉酶的抑制类型与其它植物提取物不完全一致。水提取物对α-淀粉酶为可逆非竞争性抑制;正丁醇提取物对α-淀粉酶为可逆混合性抑制,属于反竞争性和非竞争性混合抑制,类似于非竞争性抑制作用。该类混合抑制的特点是双倒数曲线相较于第三象限,ES+IEIS的平衡常数小于Kis;石油醚提取物对α-淀粉酶为不可逆竞争性抑制,属于底物型不可逆抑制,亦即邹承鲁教授提出的竞争性不可逆抑制。刘华[27]研究表明,大黄酸对α-淀粉酶是一种可逆竞争性抑制剂,并与对照阿卡波糖进行了对比。另外,随大黄酸浓度增加,大黄酸诱导α-淀粉酶空间构象变得更加精密而不利于活性中心形成。刘自琴[36]研究表明,红茶和绿茶浸提液对猪α-淀粉酶均为可逆非竞争性抑制,且该相互作用过程中,α-淀粉酶紫外吸收强度增加,绿茶浸提液使吸收峰发生红移。这说明,不同的植物种类或溶剂提取物,对不同的酶具有不同的抑制类型,主要取决于提取物有效成分的化学结构。

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