抗真菌多肽APS-1的分离纯化与特性

吴逸璘

吉尔生化（上海）有限公司 上海 200241

植物病害经常导致农业生产的重大损失。化学杀菌剂在控制作物病害中起重要作用。然而，病原真菌的多样性和可变性使得难以化学控制该疾病；此外，化学灭菌引起了环境污染和生态平衡的广泛关注。因此，植物病害的生物防治受到越来越多的关注。同时，研究新型抗菌物质在预防和治疗人类和动物疾病中的应用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 菌株

试验所用菌种蜡状芽孢杆菌，病原真菌棉花枯萎病菌、南瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、芥菜炭疽病菌、玉米小斑病菌、柑橘炭疽病菌及黑曲霉菌由西南农业大学生物技术研究中心提供。

1.2 主要试剂

DEAE52纤维素，Whatman产品；SephadexG100Pharmacia产品；硅胶GF254，青岛海洋化工厂产品；胰蛋白酶，Difco进口包装；蛋白酶K，BM产品；碱性蛋白酶，无锡酶制剂厂生产。

1.3 培养基

KMB培养基：每升20克三角蛋白，10克甘油，41.5克K2HPO，1.5克 MgSO4·7H2O，pH7.0；GPS培养基：每升 0.35g柠檬酸钠，KH2PO40.7g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.1g，葡萄糖10g，蛋白胨2.5g。

1.4 抑菌物的提取与纯化

粗菌提取物：过滤培养液后，调节pH至3.5，以5000r/min离心，用少量蒸馏水溶解沉淀，调节pH至7.0，真空干燥，加入80%甲醇至完全提取物，以4000r/min提取提取物进行离心。加入上清液，快速搅拌2.5体积的乙醚并以4000r/min离心，浓缩所得上清液并干燥，得到粗提物。

SephadexG100色谱和DEAE52纤维素色谱：在LKB自动柱色谱系统上进行。用0.05mol/LNaHCO3缓冲液（pH8.0）平衡SephadexG100，填充在柱（16mm×800mm）中，加载100mg，用平衡缓冲液洗脱，流速为18mL/h，并在275℃检测。纳米。收集级分，每管3mL，滤纸用于测量每个管的抗菌活性。将预处理的DEAE52纤维素用0.02mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.6）平衡，填充在柱（16mm×100mm）中，加载50mg，用50mL缓冲液冲洗，然后与0一起使用。用10mL/h的梯度洗脱~0.8mol/LNaCl的缓冲溶液，用滤纸盘法测定各管的抗菌活性。

硅胶薄层色谱：使用硅胶GF254制备薄层色谱板（20cm×20cm×0.25mm），将薄层在105℃下活化1小时，然后用水溶液点样DEAE52层析后的S-1抗真菌物质溶液。筛选后，选择以下层构建体层：乙醇：乙酸：水（100：5：20），正丁醇：乙酸：水（100：5：20），正丁醇：乙醇：乙酸：水（30：70：5：20），甲醇：丙酮：乙酸：水（75：25：5：20），在形成完成后干燥，碘着色，并测量Rf值。同时，使用黑曲霉孢子进行生物发育。

1.5 抗真菌物质特性研究

抗真菌物质的溶解性：酸沉淀后的0.1g干燥粗粉分别用2mL水，甲醇，乙醇，丙酮，苯，乙醚和氯仿萃取，并将20μL萃取物施加到滤纸上并干燥。然后，将其涂布在含有黑曲霉孢子溶液的PDA双层平板上，在28℃下培养48小时，测定抑制区的直径，重复4次。

抗真菌物质的离子性质：纸浆电泳0.1mol/L醋酸缓冲液（pH4.0）和0.05mol/L巴比妥酸盐缓冲液（pH8.6）（新华1号滤纸，1.5cm×25cm），电压300V，时间2h，电泳后生物发育，以黑曲霉为指示菌，测定抗真菌物质的迁移距离，重复4次。

抗真菌物质的特性：将硅胶色谱法后具有抗菌活性的部分刮下，用甲醇浓缩，然后进行TLC，薄板为20cm×220cm×0.25mm，活化1小时，分层剂丁醇：乙酸：水（65：10：25），在室温下分层。在干燥该层后，喷洒黑曲霉孢子用于生物发育，并分别使用茚三酮，缩二脲试剂，二苯胺，联苯胺，铁氰化钾-氯化铁，酪氨酸显色剂。制作喷雾颜色。

抗真菌物质的稳定性：将0.2g粗粉溶于20mL无菌水中，过滤并用微孔膜（0.22μm）灭菌，并按如下方法处理：（1）高压灭菌（1.5kg/Cm2，30min）处理；（2）30W紫外灯，24h照射 30h。将10μL上述每种处理液和未处理的对照溶液点在滤纸上，干燥，并连接到具有黑曲霉孢子悬浮液的PDA（20mL/皿）双层板上。重复四次以测量抑制区的大小。

通过抗真菌物质抑制真菌孢子萌发：孢子萌发试验是指Broekaert等人的实验方法，将测试孢子悬浮在含有不同浓度的纯化抗真菌物质的GPS培养基中，孢子浓度约为3-4×103/m。试管的直径为16mm，每管300μL，并在25℃下保湿和培养。在显微镜下观察孢子萌发，并且不使用抗真菌物质的处理用作对照。

表1 APS对黑曲霉孢子萌发的影响

2 结果与分析

2.1 APS对黑曲霉孢子萌发的影响

结果表明，在没有APS培养基（最终孢子密度为3×106/ml）的情况下，黑曲霉孢子的萌发可分为三个阶段：培养6小时，孢子开始扩展成圆形孢子；并培养7-8小时。孢子球开始发芽，胚芽管形成并生长；培养9-10小时后，菌丝在胚芽管顶端生长，菌丝体不断生长。在含有不同浓度APS的YPG培养基中，当APS浓度≤2.5μg·ml-1时，大多数孢子进入萌发期I.随着处理浓度的增加，孢子形成的概率逐渐增加；当APS浓度≥7.5μg·ml-1时，扩大的孢子球以编织形状变形，变成不规则的孢子球（表1）。胚芽管的萌发与孢子球的膨胀正相关。随着抗菌物质浓度的增加，发芽率急剧下降，胚芽管的长度变短。可以看出，APS对黑曲霉孢子萌发的三个阶段具有强烈的抑制作用。用不含YPS的YPG液体培养基洗涤孢。

结果表明，当处理浓度为 5.0，10.0，15.0μg·ml-1时，抑制性孢子恢复正常的比例逐渐降低，分别为94.8%，82.1%和45.0%，表明孢子活性。经过APS处理孢子有一定程度的减少。

2.2 抗真菌物质的特性

溶解特性：抗真菌物质在甲醇，乙醇和水中的溶解度最高，其次是丙酮，脂溶性溶剂醚，苯和氯仿的抗菌活性，表明抗菌物质是水溶性和酒精-易溶。溶剂极性强，溶解度也大。

吸收光谱：扫描结果表明，抗真菌物质的纯化产物在275nm处具有吸收峰，这与典型的蛋白质吸收峰相同。

离子特性：纸电泳结果表明，pH4.0缓冲液中S-1抗真菌物质的迁移距离为0.0cm，而pH8.6的缓冲液中迁移距离为4.6cm。拮抗物质呈弱酸性。

对水解蛋白酶的敏感性：抗真菌物质对不同的蛋白酶具有不同的敏感性。用胰蛋白酶，蛋白酶K和碱性蛋白酶处理后，它们的活性分别为未处理对照的82%，75%和71%。该结果表明该物质对上述蛋白酶具有一定的耐受性并具有环肽的特征。

APS-1的氨基酸组成：APS-1的氨基酸组成分析表明它由10个氨基酸组成，包括未知的异常氨基酸。在鉴定的9种氨基酸中，酸性氨基酸（Glu和Asp）的相对含量为47.49%，极性氨基酸（Glu，Asp，Tyr，Ser，Thr）为76.28%，缺乏碱性氨基酸。氨基酸组合物与APS-1呈弱酸性，并且与极性溶剂相容。

3 结语

芽孢杆菌可以产生肽抗生素。这些抗生素的肽链大多是封闭的，几乎没有游离氨基和羧基，这可以耐受蛋白酶的作用。由蜡状芽孢杆菌S-1菌株产生的抗真菌物质APS-1在275nm处具有吸收峰，缩二脲反应为阳性，并且茚三酮反应为阴性，但在酸水解后，茚三酮反应为阳性[1]。水解蛋白酶具有一定的耐受性，这些特征与报道的芽孢杆菌产生的环肽抗生素一致。APS-1水解产物的氨基酸组成分析证实它由9种常见氨基酸和一种异常氨基酸组成，并且推断出APS-1是环状多肽。

在芽孢杆菌产生的抗微生物肽中，大多数对细菌具有抗性，只有少数是抗真菌的。在报道的芽孢杆菌抗真菌多肽抗生素中，大多数抗菌活性不强，抗菌谱较窄，同时不能抑制丝状真菌和酵母菌等。从蜡状芽孢杆菌中纯化出抗真菌环肽Mycocerin，具有广谱抑制作用和强活性，同时可作用于丝状真菌和酵母，具有良好的耐热性和稳定性。从蜡状芽孢杆菌S-1菌株分离和纯化的抗真菌多肽APS-1也具有上述特征，但氨基酸组成明显不同。