海蛾乙酸乙酯提取物的分离纯化及抗肿瘤活性分析

蔡振辉， 陈金梅， 陈东海， 胡圣学， 蔡鲜群， 陈胜男， 石贤爱, 2

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福州大学药物生物技术与工程研究所， 福建 福州 350116)

0 引言

海蛾又称海麻雀、 海燕， 其在分类学上属辐鳍鱼纲海蛾鱼目海蛾鱼属， 主要分布在西太平洋及印度洋的热带及亚热带水域， 在我国主要分布在东海南部、 台湾海峡及南海[1]. 在古代， 我国沿海地区人民就有将海蛾作为药用的传统， 现代《中国海洋药用生物》、 《中国有毒鱼类和药用鱼类》、 《中国动物药》等书均相继收载. 海蛾性味轻辛、 苦、 平， 其全身具化痰止咳、 宣肺透疹、 壮阳补骨、 消瘿散结、 燥湿止泻等功效. 我国民间所捕获海蛾， 在去除内脏等器官后， 用清水洗净， 晒干， 可作为药用治疗甲状腺肿癌淋巴结核、 小儿气管炎、 麻疹、 腹泻等疾病[2].

海蛾中含有天然牛磺酸、 神经酰胺、 甾醇等多种物质， 其中牛磺酸对大鼠发生肝癌时的脂质过氧化和膜裂解反应的肝起保护作用， 并能对大鼠慢性酒精中毒的肝脂肪变性和脂质过氧化提供保护、 对肠炎具有较好的疗效以及能对在常压低氧急性条件下的肝、 大脑、 心脏提供保护[3]. 唐孝礼等[4]使用氢化可的松或环磷酰胺降低老年小鼠的免疫力， 随后使用海蛾提取物处理小鼠， 发现小鼠脾脏和胸腺重量显著增加， 提高了老年小鼠的免疫力水平. 海蛾提取物对小鼠免疫水平的调解， 对免疫水平正常的小鼠没有明显作用， 但当小鼠因衰老、 药物抑制等原因造成免疫力下降时， 海蛾提取物可以改善机体免疫水平， 抵御病原体的侵害. 另有研究表明， 利用75%(体积分数)乙醇提取海蛾获得的提取物抗氧化作用最为明显， 利用乙酸乙酯和正丁醇进一步萃取获得的产物具有最佳活性[5-6].

由于目前缺乏海蛾活性组分的分离纯化及定性定量研究数据， 致使对海蛾的深入研究和利用处于停滞状态. 相比传统的硅胶柱萃取等方法， 由分析型液相色谱发展而来的制备型液相色谱能够高效地分离纯化混合有机组分， 具有更加简便、 高效的特点[7]. 因此， 本研究使用制备型液相色谱， 在对海蛾活性成分进行分离纯化的基础上， 采用3D-HPLC技术同步分析多种物质组分[8-11]， 同时结合MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)法和流式细胞术的技术优势[12-15]， 进行各组分的抗肿瘤活性分析， 希望为海蛾活性成分的进一步利用奠定基础.

1 材料与仪器

1.1 材料

海蛾乙醇-水-乙酸乙酯浸提物(海蛾全鱼干品购自广州黄沙药材批发市场)； DMEM 培养基购自美国Gibco公司； 胎牛血清购自美国Hyclone 公司； 胰蛋白酶购自美国Amresco 公司； 二甲基亚砜( DMSO) 、 噻唑蓝( MTT) 购自美国Sigma 公司; 6孔、 96 孔细胞培养板购自美国Costar 公司； 其他化学试剂均为色谱纯， 购自国药集团化学试剂有限公司.

人乳腺癌细胞(MCF-7)、 人肺癌细胞(A549)、 人肝癌细胞(HepG-2)、 子宫颈癌细胞(HeLa)、 人肾上皮细胞(293T)均购自中科院上海细胞所. 培养基均为含10%(体积分数)无支原体胎牛血清和1%(体积分数)双抗(青霉素-链霉素)的DMEM高糖培养基.

1.2 仪器

CO2培养箱(NUAIR 550， 美国Nuaire公司)； 荧光全自动酶标仪(SH-1000， 日本Corona公司)； 超纯水器(GZY-P10-Y， 湖南科尔顿公司)； 超声波清洗器(2200， 昆山超声仪器公司)； 旋转蒸发仪(XMTF-6000， 上海申生公司)； 真空干燥箱(DZF-6020， 上海精宏公司)； 高效液相色谱(分析型： BREEZE系列， 1525二元泵， 2996检测器， 美国Waters公司)； 高相液相色谱(半制备型： BREEZE系列， 1525EF二元泵， 2998检测器， 美国Waters公司)； 液相色谱超高分辨质谱联用仪 (Exactive Plus， 美国赛默飞世尔公司)； 超导核磁共振波谱仪(AVANCE III 400 MHz， 瑞士布鲁克公司)； 傅里叶变换红外光谱系统(Nicolet iS50， 美国赛默飞世尔公司).

2 方法

1) 色谱条件. 色谱柱： 分析柱(SinoChrom ODS-BP， 4.6 mm×250 mm， 大连依利特公司)； 半制备柱(SinoChrom ODS-BP， 20.0 mm×250 mm， 大连依利特公司). 流动相： 甲醇(A), 超纯水(B)； 梯度洗脱(0～30 min， 60%～100%(体积分数)A； 30～60 min， 100%A). 分析条件： 流速1.0 mL·min-1， 检测波长202 nm， 柱温25 ℃； 进样量15 μL， 采样时间60 min. 制备条件： 流速10.0 mL·min-1， 检测波202 nm， 柱温25 ℃； 进样量3～4 mL， 采样时间60 min.

2) 样品处理. 称取0.1 g海蛾乙酸乙酯提取物， 溶解于2 mL纯甲醇溶液， 用有机滤膜过滤除去杂质后进行分析.

3) 保留时间重现性验证. 取海蛾乙酸乙酯样品， 平均分成5份， 进行5次平行试验， 分别记录下A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6等组分出峰时的保留时间， 计算平均值及相对标准偏差，

4) 制备方法. 称取2 g海蛾乙酸乙酯提取物， 溶解于50 mL纯甲醇溶液， 置于超声波清洗器中使样品充分溶解. 随后将样品通过有机滤膜过滤除去杂质， 设置半制备液相色谱各项参数后， 进样3 mL， 按洗脱出峰时间顺序依次收集组分， 分别命名为A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6.

5) 基于HPLC的单组分鉴定. 依据色谱条件， 设置分析型HPLC参数， 进样针吸取20 μL A1样品进样， A2、 A3、 A4、 A5、 A6等样品依次进样， 记录HPLC色谱图以及3D-HPLC色谱图进行纯度验证.

6) MTT法检测各组分对肿瘤细胞增殖影响. 在37 ℃， 5%(体积分数)CO2环境下， 将人乳腺癌细胞MCF-7、 人肺癌细胞A549、 人肝癌细胞HepG-2、 子宫颈癌细胞HeLa和正常细胞系人肾上皮细胞293T 培养细胞至对数生长期， 随后消化计数， 分别接种至96孔板( 细胞数2 × 104个·mL-1). 每种细胞分别设置6组浓度梯度， 并设5 个复孔， 继续培养18～24 h. 待细胞贴壁后， 第1梯度加入10 μL PBS 作为空白对照， 第2～6 梯度分别加入质量浓度为4.0、 2.0、 1.0、 0.5、 0.25 mg·mL-1的样品组分10 μL， 在培养箱中培养24 h后， 每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL， 孵育48 h后弃上清， 并添加100 μL DMSO， 轻轻摇动， 设置酶标仪参数， 于510 nm测定吸光度值(A). 计算细胞抑制率.

7) 流式细胞仪分析结果. 悬浮细胞离心(2 000 r·min-1离心5 min)收集， 贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化30～60 s； 用PBS洗涤细胞两次， 离心(2 000 r·min-1离心5 min)， 收集1～5×105个细胞； 加入500 mL Binding Buffer悬浮细胞、 5 μL Annexin-V-FITC以及5 μL propidium Iodide， 轻轻混匀； 室温、 避光反应5～15 min， 在1 h内进行流式细胞仪的检测和观察. 同时以不加Annexin V-FITC 及PI的一管作为阴性对照. 设置流式细胞仪参数为激发波长λEx=488 nm， 发射波长λEm=530 nm； Annexin V-EGFP的绿色荧光以FITC通道(FL1)检测； PI红色荧光以PI通道(FL3)检测.

8) 化学结构分析. 制备各分离单组分， 进行核磁共振检测， 溶剂为氘代氯仿； 质谱测定， 电离模式ESI； 液相红外光谱测定， 溶剂为甲醇.

3 结果与讨论

3.1 样品分离结果

图1 乙酸乙酯提取物各组分保留时间Fig.1 Retention time of components from ethyl acetate extract

对海蛾乙酸乙酯提取物进行分析发现， 样品中主要有6个组分， 按顺序分别编号为A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6(见图1). 使用半制备型HPLC进行各组分的收集， 结合3D-HPLC对获得的组分进行全波长扫描， 判定6种组分为单组分(见图2).

图2 A1～A6组分的3D-HPLC分析图Fig.2 3D-HPLC chromatograms of the sub-component A1 to A6

3.2 组分的抗肿瘤活性

根据MTT实验结果， A1组分对人乳腺癌细胞MCF-7具有轻微抑制作用， 促进子宫颈癌细胞HeLa的生长， 而对人肺癌细胞A549、 人肝癌细胞HepG-2、 人肾上皮细胞293T并无明显抑制作用(多种药物质量浓度对细胞抑制率均小于50%)； A2、 A3组分对人乳腺癌细胞MCF-7、 人肝癌细胞HepG-2、 人肾上皮细胞293T等均具有较强的抑制作用， 并对人肾上皮细胞293T的抑制较为明显(IC50值分别为(203±3.45)、 (168±3.67)μg·mL-1)； A4组分对各种细胞均有很强的抑制作用， 但对人肺癌细胞A549、 人乳腺癌细胞MCF-7、 人肾上皮细胞293T的IC50均不同程度小于人肝癌细胞HepG-2(IC50值(288±4.58)μg·mL-1)、 子宫颈癌细胞HeLa(IC50值(311±8.96) μg·mL-1)， 见图3. 以此判断以上4种组分对多种癌细胞抑制作用较弱， 或抑制正常细胞的生长， 故不作为后续研究对象.

相较而言， A5、 A6既能抑制肿瘤细胞的生长， 又对人肾上皮细胞293T仅有较低的抑制率. 其中， 组分A5能抑制多种肿瘤细胞生长： 对子宫颈癌细胞HeLa 的生长抑制作用相对较强， IC50值为(302.4±2.33) μg·mL-1； 对人乳腺癌细胞MCF-7、 人肺癌细胞A549也显示出了较强的抑制作用； 但对人肾上皮细胞293T抑制较弱(IC50值大于400 μg·mL-1). 组分A6对人肾上皮细胞293T抑制较弱， 但对多种肿瘤细胞具有抑制作用， 且该抑制作用具有剂量依赖性. 其中组分A6对子宫颈癌细胞HeLa 的生长抑制作用最强， IC50值为(50.98±3.43) μg·mL-1， 400 μg·mL-1浓度下抑制率达到88.8%， 与此同时， 药物人对肾上皮细胞293T的抑制率始终未超过50%. 比较A5、 A6与5-氟尿嘧啶对人宫颈癌细胞HeLa 的抑制作用， 在相同实验条件下二者较5-氟尿嘧啶(IC50值(415.4±0.82) μg·mL-1)均具有不同程度降低， 因而抑制作用更强， 表明A5、 A6具有潜在的研究价值， 故选用A5、 A6进行下一步研究.

图3 A1～A6处理48 h对5种细胞的生长抑制曲线Fig.3 Growth inhibition curves of 5 kinds of cells after treatment with components A1～A6 for 48 h

3.3 组分诱导细胞凋亡的研究

根据MTT实验结果， 可知A6的抑制肿瘤活性明显高于A5， 结合抑制曲线， 设定A5药物质量浓度梯度为100、 200、 300、 400 μg·mL-1， A6药物质量浓度梯度为50、 100、 150、 200 μg·mL-1. 通过流式细胞仪对A5、 A6组分诱导细胞凋亡进行研究(见图4). 结果显示， 随着药物质量浓度的增加， HeLa 细胞的凋亡程度均有不同程度增加. 其中， A5在质量浓度为400 μg·mL-1时进入凋亡早期的细胞为76.4%， 进入凋亡晚期或死亡的细胞为24.7%； A6在质量浓度为200 μg·mL-1时进入凋亡早期的细胞为86.4%， 进入凋亡晚期或死亡的细胞为13.3%. 相比A5组分， A6组分更易促进细胞向凋亡晚期转变或死亡， 证实组分A5、 A6对HeLa细胞的增殖抑制作用通过诱导HeLa凋亡途径实现.

图4 Annexin V/PI 双染法检测组分A5、A6对HeLa 细胞的诱导凋亡作用Fig.4 Determination of induced-apoptotic effect of components A5 and A6 on HeLa cells through AnnexinV/PI dual stainting assay

3.4 组分A5、 A6化学结构分析

对A5、 A6进行质谱分析， 利用MS测定结果， 推测组分A5的相对分子质量为284， 核磁共振测试结果：1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.56, 7.54, 7.38, 7.29, 7.16, 7.15, 7.14, 7.13, 5.49, 5.47, 5.43, 5.41, 5.39, 5.38, 5.36, 5.32, 5.29, 2.38, 2.36, 2.04, 2.02, 1.65, 1.63, 1.35, 1.32, 1.30, 1.28, 0.94, 0.91, 0.90, 0.88；1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.55 (d,J=8.6 Hz, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.15 (dd,J=8.6, 2.3 Hz, 1 H), 5.52～5.26 (m, 3 H), 2.37(d,J=7.5 Hz, 7 H), 2.03(d,J=5.7 Hz, 5 H), 1.64(d,J=6.6 Hz, 7 H), 1.60～1.58(m, 1 H), 1.31(dd,J=18.3, 12.4 Hz, 83 H), 0.91(dd,J=15.5, 9.2 Hz, 24 H). A6组分的相对分子质量为773， 核磁共振测试结果：1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.29, 5.73, 5.35, 4.19, 4.16, 4.14, 4.12, 4.10, 4.09, 4.08, 3.55, 3.53, 3.52, 3.51, 3.50, 2.38, 2.36, 2.35, 2.32, 2.29, 2.27, 2.24, 2.03, 2.02, 2.00, 1.95, 1.85, 1.83, 1.56, 1.54, 1.52, 1.51, 1.50, 1.34, 1.30, 1.26, 1.19, 1.12, 1.11, 1.05, 1.01, 0.93, 0.91, 0.88, 0.86, 0.72, 0.68；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ5.73(s, 4 H), 5.35(s, 19 H), 4.22～4.05(m, 11 H), 3.57～3.31(m, 18 H), 2.24(s, 1 H), 2.07(dd,J=48.7, 45.9 Hz, 41 H), 1.81(dd,J=73.8, 63.6 Hz, 69 H), 1.60～1.47(m, 61 H), 1.36～1.20(m, 199 H), 1.19(s, 26 H), 1.12(d,J=6.7 Hz, 35 H), 0.88(ddd,J=77.8, 60.4, 14.7 Hz, 325 H), 0.70(d,J=12.5 Hz, 54 H), 0.70(d,J=12.5 Hz, 47 H).

由于样品相对分子质量较大， 需较多样品量进行核磁共振测试， 加之前期原料来源较少， 在经过分离纯化步骤后大多已消耗完毕， 样品浓缩过程中也似乎降低样品纯度， 致使核磁共振图谱分析难度加大， 因而难以准确分析出化合物化学结构. 对于A5， 结合红外图谱在1 050 cm-1处存在很大透过率， 推测A5为相对分子质量约284的芳香族类有机小分子化合物； 组分A6， 其核磁共振图谱中位于高场的氢较多， 联系红外谱图， 推测该化合物为相对分子质量为773的甾体类或萜类有机化合物.

4 结语

通过对海蛾乙酸乙酯提取物的分离纯化及其抗肿瘤活性实验， 表明海蛾作为传统治疗药物确有功效， 本实验可为海蛾作为抗肿瘤药物的研究提供参考.

参考文献：

[1] 项辉, 黄海. 海蛾的药用价值及有效成分[J]. 中药材， 2004， 27(5): 318-320.

[2] 李瑞声, 许实波. 海洋药物海蛾(PegasuslaternariusCuvier)化学成份的研究[J]. 中山大学学报(自然科学版), 1993(3): 46-52.

[3] 刘文惠, 项辉, 张穗屏, 等. 海蛾甲醇提取物对小鼠脑脂质过氧化及抗氧化酶的影响[J]. 中药材, 2001， 24(9): 668-670.

[4] 唐孝礼, 颜光美, 许实波. 海蛾提取物对小鼠免疫器官重量和抗应激能力的影响[J]. 中药材, 1999， 22(6): 300-303.

[5] 李坤龙, 陶华明, 周雪峰. 海蛾提取物的抗氧化活性及其化学成分[J]. 海洋渔业, 2015, 37(6): 565-569.

[6] DELGADO-ANDRADE C, RUFIAN-HENARES J A, MORALES F J. Assessing the antioxidant activity of melanoidins from coffee brews by different antioxidant methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(20): 7832-7836.

（三）茶旅融合不紧。长期以来，永川茶产业发展偏重于茶叶基地建设和一般的生产、加工、营销，对特色茶旅游产品开发和茶文化的挖掘、培育、宣传亟待加强。游客对永川旅游的认知仍停留在“走马观花”的表浅旅游，参与互动式旅游和深度文化体验等旅游形式和项目开发不足。两年一届的茶旅节，基本成为以招商为主的商贸洽谈会。茶旅融合度低，直接导致茶产业的发展一直徘徊在最基础的第一产业层次，附加值远远未得到提升。

[7] 徐皓. HPLC法测定不同产地元胡药材中5种生物碱含量[J]. 药物分析杂志, 2015, 132(8): 1403-1407.

[8] BHANDARI P, KUMAR N, SINGH B,etal. Simultaneous determination of sugars and picrosides inPicrorhizaspecies using ultrasonic extraction and high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1194(2): 257-261.

[9] HUO L, JIANG Z, LI H,etal. Simultaneous determination of seven major diterpenoids inSiegesbeckiapubescensMakino by high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Separation Science, 2012, 35(19): 2585-2591.

[10] LEE J, YANG D H, SUH J H,etal. Species discrimination ofRadixBupleurithrough the simultaneous determination of ten saikosaponins by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection and electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2011, 879(32): 3887-3895.

[11] WANG S, YANG F Q, FENG K,etal. Simultaneous determination of nucleosides, myriocin, and carbohydrates inCordycepsby HPLC coupled with diode array detection and evaporative light scattering detection[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(23/24): 4069-4076.

[12] BURTON J D. The MTT assay to evaluate chemosensitivity[J]. Methods Mol Med, 2005, 110: 69-78.

[13] 陈新峰, 杨菁. 用MTT法进行白血病体外药物敏感性检测的临床意义[J]. 福建医科大学学报, 2009, 43(2): 169-171.

[14] 张银霞. 肿瘤药敏试验方法及临床应用[J]. 医学综述, 2003, 9(1): 34-35.

[15] 傅扬, 黄平, 胡劲松. 活体流式细胞术在肿瘤转移研究中的应用[J]. 健康导报(医学版), 2015(8): 43.