人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

林士森， 刘玮洁， 林靖颖， 杨楠楠， 刘树滔

(福州大学生物工程研究所， 福建 福州 350002)

0 引言

胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase， EC-SOD)是一类含Cu、 Zn原子的SOD酶类, 可高效催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2与O2, 能够清除体内多余的氧自由基[1]， 在组织损伤修复、 口腔癌、 肺损伤等方面的治疗有明显效果[2-4]， 具有较高潜在价值. 但EC-SOD在生物体内的含量远低于其它SOD同工酶， 目前主要从动物主动脉和肺部中提取， 提取工艺繁琐且最终获取量较低， 不利于工业化生产应用[5-6]. 工业生产中为了解决产量少的问题， 通常利用基因工程技术构建高效表达菌株， 便于制备大量EC-SOD投入于生产应用. 但在许多表达系统中， 如细菌表达系统， 存在无法对真核蛋白进行正确的加工处理、 表达蛋白常以包涵体形式存在等一系列问题[7-8]； 在哺乳动物系统中， 其表达重组蛋白结构与天然蛋白高度相似但表达量较低[9]. 因此采用甲醇营养型毕赤酵母表达体系， 表达的目的蛋白能够分泌至胞外， 有利于工业上的分离纯化， 其表达的蛋白能够形成二硫键、 糖基化修饰等高级结构， 且表达量高， 与天然蛋白相似， 为人源EC-SOD的获取提供了极大的便利[10].

目前已有构建EC-SOD表达菌株的少量报道， 在酵母表达系统的研究中[11]， 其发酵液通过超滤浓缩后， EC-SOD表达量也仅有0.45 mg·mL-1， 酶活力为760 U·mg-1， 可见其构建的表达菌株并不能满足工业化需求， 并且N端存在多余氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 使重组蛋白与天然EC-SOD的N端结构存在一定差异. 本研究在前人基础上， 致力于改善酶活较低， N端非天然产物等问题， 以人源EC-SOD基因为出发点， 对比毕赤酵母最适密码子并对其修改， 以期显著提高毕赤酵母的表达水平， 且与天然EC-SOD结构更加相似. 研究利用基因工程技术构建EC-SOD毕赤酵母表达菌株， 并对其表达的EC-SOD进行性质分析与酶活力测定.

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

pUC57由上海生工公司合成； 扩增菌株JM109、 表达菌株PichiapastorisX33及表达载体pPICZαA购自美国Invitrogen公司.

1.2 主要药品与试剂

DNA marker DL5000、 DL2000， 限制性内切酶EcoR I、SacI、XhoI、SalI、 PCR mix等购自日本Takara公司； UNIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒、 琼脂糖胶回收试剂盒、 Protein Molecular Weight Marker等购自上海生工生物工程公司、 美国Thermo Fish公司； 酵母提取物及胰蛋白胨等为美国Sigma公司产品； DEAE离子交换树脂为日本TOSOH公司产品； 其余试剂药品均为分析纯.

1.3 实验方法

1.3.1 表达载体的构建

由上海生工公司合成的含有人源EC-SOD密码子优化后基因(687 bp)的pUC57质粒， 质粒设计中在基因前后加入XhoⅠ(上游)和EcoRⅠ(下游)两个酶切位点， 同时引入2个碱性氨基酸Lys 和Arg以实现目的蛋白的胞外分泌. 最终确定引物上游为CTCGAGAAAAGATGGACTGGTGA及下游引物为GAATTCTTAAGCAGCCTTACATTCAG.

将pPICZαA质粒用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切切开， 并从pUC57质粒上使用相同切下含有目的片段的序列(使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切后序列大于目的基因序列， 但由于在设计基因序列中尾端含有终止密码子， 所以多余序列不影响表达)连接至pPICZαA载体上， 筛选重组质粒pPICZαA-EC-SOD， 转E.coli.(JM109)， 筛选表达菌株JM109-EC-SOD提取质粒经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切并PCR验证筛选出目的菌株， 进一步使用SacⅠ线性化重组质粒进入毕赤酵母X33， 提取酵母基因组DNA经验证筛出目的菌株.

1.3.2 毕赤酵母的诱导与表达

目的蛋白的实验参考Invitrogen公司毕赤酵母表达手册说明书. 重组菌株Pichia.(X33) 置于YPD 培养基中， 30 ℃摇培24 h后， 按1%的接种量转接至不含葡萄糖的YP培养基中培养， 待OD600= 3.0～5.0开始诱导(诱导前取样)， 按1%(体积分数)的诱导剂量添加甲醇， 每隔24 h补加甲醇至终体积分数为1%并取样1 mL测酶活， 在诱导第6天和第7天后酶活趋于稳定， 无明显增加， 因此只需诱导5 d.

1.3.3 EC-SOD初步分离纯化

由于目的蛋白理论等电点为6.4左右， 在pH值为8的条件下， 能使杂蛋白吸附到DEAE弱阴离子交换树脂上， 目的蛋白不能被吸附， 从而起到分离的作用. 因此将发酵液离心后， 取上清3 L进行硫酸铵沉淀， 用30 mL pH值为8的缓冲液溶解沉淀， 并用截留相对分子质量为3 500 u隔夜透析. 使用柱体积30 cm×φ1 cm的层析柱， 以1 mL·min-1流速上样5 mL样品， 收集穿透峰并用OD280检测及酶活测定， 验证其中含有重组蛋白EC-SOD.

1.3.4 EC-SOD活性定性检测

对发酵液12 000 r·min-1离心10 min， 收集上清， SDS-PAGE 观察分析. 上清液与初步分离纯化样品采用盐酸羟胺法测定SOD酶活力[12]， NBT活性电泳染色[13].

2 结果分析

2.1 表达载体的构建与验证

以pPICZαA质粒为真核表达载体， 构建EC-SOD基因毕赤酵母表达质粒， 经EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切(见图1)及PCR验证(见图2). 箭号处为目的基因， 且重组质粒经测序检验含有目的基因， 这些结果均表明目的片段已成功连接至表达载体上.

随后将重组质粒使用SacⅠ线性化后， 电转化至毕赤酵母X33中， 在Zeocin抗性平板挑取单菌落培养并提取酵母基因组DNA， 进行PCR验证(见图3).

图1 重组质粒PCR产物Fig.1 PCR identification of the recombinant

图2 重组质粒双酶切Fig.2 Enzyme digestion identification of the recombinant

图3 酵母基因组PCR验证电泳图Fig.3 PCR identification of the chromosome of Pichia pastoris

2.2 rcEC-SOD诱导与表达及活力鉴定

25 mL培养基在100 mL三角瓶中培养并诱导5 d， 收集每日菌液离心取上清， 进行SDS-PAGE分析(见图4)， 并使用盐酸羟胺法测定SOD酶活. 结果表明， 最终活力为178 U·mL-1， 比活为508 U·mg-1， 酶活随诱导天数增加而升高(见图5).

图4为毕赤酵母X33重组菌株表达产物的SDS-PAGE电泳图. 电泳结果显示， 在相对分子质量为17与40 ku处， 诱导前未表达EC-SOD， 诱导后出现EC-SOD的蛋白条带(见图4上下箭头部分)， 且蛋白质条带伴随着诱导时间的增加而逐渐加深.

图4 毕赤酵母EC-SOD-X33发酵液上清电泳图Fig.4 SDS-PAGE analysis of the supernatant from Pichia pastoris

图5 毕赤酵母诱导过程中酶活变化趋势图Fig.5 Activity change trend of EC-SOD during the induction of Pichia pastoris for 5 days

2.3 rcEC-SOD初步分离纯化

发酵液上清经过硫酸铵沉淀， 透析后使用DEAE弱阴离子交换树脂进行初步分离纯化， 在pH=8.0时上样收集穿透峰， 用1 mol·L-1NaCl溶液洗脱杂蛋白. 纯化结果如图6所示， 箭头处为穿透峰， 经酶活测定穿透峰中含有大量EC-SOD， 洗脱峰中未检测到酶活性， 说明其中不含有EC-SOD. 收集穿透峰进行SDS-PAGE， 结果如图7所示， 穿透样品在17与40 ku处出现EC-SOD的蛋白条带， 进一步证实EC-SOD富集在穿透峰.

图6 EC-SOD-X33 DEAE弱阴离子交换树脂初步分离Fig.6 Purification of EC-SOD in DEAE resin

图7 EC-SOD-X33 DEAE弱阴离子交换树脂初步分离Fig.7 Preliminary preparation with DEAE resin

2.4 rcEC-SOD活性电泳染色

为进一步验证纯化后蛋白活性， 进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法活性定性检测. 取发酵液上清与过DEAE弱阴离子树脂初步分离纯化液进行Native-Page凝胶电泳后， 利用NBT法对PAGE胶进行活性定性检测. 结果如图8、 9所示， 在没有EC-SOD的位置为蓝紫色背景， 发白位置出现清晰透明的SOD活性染色条带， 证实纯化的蛋白具有SOD酶活性.

图8 发酵上清液NBT活性染色Fig.8 Supernatant in native-page and stain with NBT

图9 初步分离纯化蛋白活性染色Fig.9 Preliminary preparation in native-page and stain with NBT

3 讨论

实验在毕赤酵母表达系统中， 成功构建重组pPICZαA质粒， 并在Pichiapastoris中成功胞外分泌表达， 分泌出的EC-SOD蛋白具有活性高、 易分离纯化、 与天然蛋白相似的特点.

在毕赤酵母构建EC-SOD表达菌株的相关研究中， 已经有学者做过相关实验[11]， 将发酵液浓缩后进行性质分析， 浓缩后比活约为760 U·mg-1， 该实验采用ELISA法定量出EC-SOD的蛋白含量， 所以比活相当于纯化后的蛋白比活. 但该研究未对EC-SOD基因进行密码子优化， N端存在多余的氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 因此表达量与结构特性等方面有待提高.

本研究在前人研究的基础上加以改进， 首先对天然EC-SOD的基因序列进行密码子优化， 从理论上能够提高酵母的表达水平， 并删去N端信号肽， 直接连接毕赤酵母中的KEX2水解酶. 其次在序列设计中， 实验设计的蛋白序列与天然的EC-SOD一致， 拥有极其相似的生理活性. 经酶活与蛋白量测定， 在25 mL摇瓶上清液的比活约为508 U·mg-1， EC-SOD蛋白表达量为0.19 mg·mL-1， 5 L发酵罐中比活约909 U·mg-1， 经DEAE初步纯化后， 比活约为1 700 U·mg-1. 因此， 本实验中发酵上清液(未浓缩)的蛋白表达量和酶活都与前人实验中浓缩后的结果相近， 甚至更好. 由于实验设计的EC-SOD的N端序列与天然一致， 因此在比活力上得到显著提升. 通过NBT染色实验， 进一步验证重组菌株表达出具有活性的EC-SOD蛋白.

在实验的最终发酵产物中， 发现可能视为单体(17 ku)与二聚体(40 ku)的重组蛋白同时存在， 也可能是杂蛋白形式存在， 但并未对其作出验证， 需通过后续实验进一步分析. 通过文献查阅得知， 天然的EC-SOD主要是以四亚基形式存在， 亚基之间是靠疏水作用结合[14-15]， 因此在SDS-PAGE仅能打断分子间的二硫键. 相关研究也表明重组表达的EC-SOD具有单体与二聚体结构共存的现象， 并且在Cu/Zn SOD中也存在类似单体与二聚体共存的情况[16]， 由此可推断EC-SOD在溶液中可能存在多聚体结构.

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