非小细胞肺癌患者外周血中miRNA-4286表达的临床意义

张建斌 闵伟伟 李鸿伟 马志红 戴利成

中国癌症统计最新数据显示，2015年我国预计新发癌症病例429.2万，癌症死亡病例 281.4万，全球恶性肿瘤相关死因中肺癌占27%，仅中国的病例就占1/3以上[1－2]。低剂量螺旋CT的广泛应用极大提高了早期肺癌的检出率，但一定程度上增加了过度辐射暴露的风险[3]。因此，探索外周血指标用以诊断肿瘤成为了研究热点。有文献报道，miRNA－4286在非小细胞肺癌（NSCLC）患者组织中异常表达[4]，提示miRNA－4286表达水平可能与NSCLC发生、发展相关。本研究通过实时荧光定量PCR技术检测NSCLC患者外周血中miRNA－4286表达水平，进一步探讨其在NSCLC诊断中的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2014年10月至2015年5月行肺癌根治性切除的NSCLC患者31例（观察组），其中男18 例，女 13 例，年龄 36～81（57.06±10.22）岁；肿瘤部位：左上肺7例（22.6%），左下肺6例（19.4%），右上肺7例（25.8%），右中肺 3例（9.7%），右下肺 7例（22.6%）；肿瘤直径：（2.43±0.13）cm；病理类型：鳞癌 10 例（32.3%），腺癌 18例（58.1%），其他包括腺鳞癌、大细胞癌及基底细胞癌各1例，共3例（9.7%）。选择同期肺部良性肿瘤手术患者20例为良性对照组，其中男12例，女 8 例，年龄 45～79（63.1±8.1）岁；肿瘤部位：左上肺 4例（20.0%），左下肺2例（10.0%），右上肺7例（35.0%），右中肺3例（15.0%），右下肺4例（20.0%）；肿瘤直径：（2.05±0.24）cm。选择同期健康体检者21例为阴性对照组，其中男 13 例，女 8 例，年龄 43～80（59.4±9.6）岁。3组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法 分别采集两组空腹血5ml保存，每份血液样本重复3次试验。

1.2.1 主要检测试剂及仪器 实时荧光定量通用试剂（上海吉玛制药技术有限公司）、FTC3000实时荧光定量PCR仪 （上海枫岭生物技术有限公司）、miRNA－4286引物序列 Has－miR－4286－FO：5′－TCTCCTGCACCCCACTCC－3′、Has－miR－4286－RE：5′－TATGGTTGTTCAC GACTCCTTCAC－3′、内参基因引物序列 Cel－mir－39－FO：5′－CGTCGATCACCGGGTGTAAA－3′、Cel－mir－39－RE：5′－TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC－3′。

1.2.2 检测方法 3组患者均在入院时采集空腹静脉血3.5ml，1600r/min离心10min，吸取上清液1.5ml置于离心管中，再次于1600r/min离心10min，吸取上清液350ml，置于离心管中并于－80℃冰箱中保存；观察组于术后第7天清晨再次抽取空腹静脉血3.5ml，重复上述步骤。

采用Trizol裂解液裂解组织并提取总RNA，RNA反转录合成cDNA，取反转录产物进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性 3min，40 个循环（95℃，12s；62℃，30s；72℃，30s）。miRNA－4286 相对含量以 ΔCT 及 2－ΔΔCT计算，完成后进行蛋白电泳检测PCR产物大小及完整性。PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

1.2.3 计算方法 miRNA－4286相对表达水平以ΔCT表示，ΔCT=（CT内参基因－CT目标基因），CT 值即循环阈值，指反应体系中荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。手术前后两组配对资料中miRNA－4286相对表达差异以 2－ΔΔCT表示，2－ΔΔCT＞1 表示目的基因表达上调，2－ΔΔCT＜1表示目的基因表达下调。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA检测结果 以目标RNA逆转录所得cDNA为模板扩增的熔解曲线单一峰，说明引物合格，无非特异扩增；以水为模板扩增的熔解曲线没有峰或只有引物二聚体的小峰，说明体系没有污染。详见图1。

图1 目标基因Has-miR-4286熔解曲线及（a）内参基因Cel-mir-39熔解曲线（b）

2.2 PCR产物大小及完整性检测结果 电泳结果显示PCR产物大小正确，无杂带，说明无非特异性扩增；电泳结果的阴性对照显示没有目的带，说明体系没有污染。详见图2。

2.3 观察组术前及术后1周外周血miRNA－4286表达水平比较 观察组术后miRNA－4286表达水平为ΔCT=－11.179±1.296，较术前（－15.423±3.631）明显增加，差异有统计学意义（t=－13.598，P＜0.05）。观察组手术前后配对分析显示93.5%的患者术后该基因表达上调（2－ΔΔCT值＞1），6.5%的患者术后该基因表达下调（2－ΔΔCT值＜1）。

2.4 3组外周血miRNA－4286表达水平比较 观察组术前 ΔCT=－15.423±3.631，低于良性对照组（－9.014±0.995）和阴性对照组（－9.459±1.019），差异均有统计学意义（t=－16.032、－14.021，均P＜0.05）；良性对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（t=2.455，P＞0.05）。

图2 Has-miR-4286扩增PCR产物电泳图（a）及Cel-mir-39扩增PCR产物电泳图（b）

3 讨论

miRNA是一种长度约19～22nt的内源性非编码RNA（ncRNA），依靠自身序列的特异性，通过抑制翻译或裂解RNA转录的方式来调节靶蛋白表达[5]。外周血中minRNA主要存在于凋亡或坏死细胞的外泌体和凋亡小体中，能保持较高的稳定性，因此对癌症诊断、预测预后有相当大的潜力[6]。自上世纪90年代以来，发现的miRNA已超过一千种，其中超过半数被证明与特定的肿瘤有密切关系；不同种类的miRNA在不同肿瘤中也扮演着不同角色（癌基因或抑癌基因）[7－8]。

miRNA－4286最早是Goff[9]研究人胚胎干细胞（hESC）早期分化过程时发现的，我们通过前期RNA芯片实验中筛选出来具有表达差异性的新型miRNA，它定位于人类染色体8p23.1，碱基序列为5′－ACCCCACUCCUGGUACC－3′，目前国内外报道较少。国内有学者通过检测血清前列腺特异性抗原（PSA）升高患者miRNA－4286的表达情况发现miRNA－4286在前列腺癌中呈高表达,与PSA在前列腺癌中的诊断效能比较，其灵敏度为68.75%，特异度为60．06%[10]。另有学者发现miRNA－4286在食管腺癌患者血清中呈高表达状态，且与患者生存率密切相关，该差异重点表现在HP阴性的患者中[11]。近几年，国外多项研究表明，miRNA－4286也与大肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的发生、发展关系密切[12－14]。

本研究选取了31例NSCLC患者、20例良性肿瘤患者及21例健康体检患者，对其外周血中miRNA表达水平分别进行比较，发现观察组中NSCLC患者术后较术前miRNA－4286表达水平明显上调，观察组术前与良性对照组和阴性对照组比较差异也有统计学意义。分析原因为：（1）miRNA－4286在NSCLC发生中发挥着类似抑癌基因的作用；（2）NSCLC患者外周血中可能存在某种抑制性上游物质，发挥负性调节作用以减少miRNA－4286表达。此外，观察组术后miRNA－4286表达水平较良性对照组及阴性对照组更低，差异有统计学意义，说明NSCLC患者术后目标RNA表达水平并未上升至正常，这可能与肺癌患者存在一定量循环肿瘤细胞有关。miRNA－4286在良性肿瘤组（－9.014±0.995）与阴性对照组（－9.459±1.019）之间差异无统计学意义，结合以上结果，笔者认为目标RNA可能与肿瘤的局部侵袭能力和远处转移能力有更强的相关性。

总之，miRNA－4286在NSCLC患者外周血中低表达，而术后患者、良性患者和健康人群则进一步上升，可以推测，目标RNA在NSCLC的发生、发展中可能作为一种抑癌基因来调节细胞的增殖和转移。然而，miRNA－4286在NSCLC中发挥其抑制作用的分子机制有待进一步研究，而且肿瘤在其发生、发展过程中可能发生miRNA表达谱的改变[15]，miRNA－4286是否也存在这种阶段特异性同样值得深入研究。

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