肺纤维化大鼠肺组织Smurf2表达变化及意义

代文静，何彬普，孙建，邱静，马春兰，李万成

(1成都医学院第一附属医院，成都610500；2中国五冶集团有限公司医院)

肺纤维化是一种慢性、进行性的间质性肺病，发病机制尚未完全明确，亦缺乏有效的治疗方法，患者预后差[1,2]。研究发现，转化生长因子β1(TGF-β1)是肺纤维化形成的关键因子，在肺纤维化的形成和发展中发挥重要作用。Smad蛋白是近年发现的参与TGF-β细胞内传导的一类信号蛋白，是TGF-β受体下游的信号转导因子，建立起细胞膜与细胞核之间的信号转导通路，TGF-β1通常与Smad蛋白形成信号传导通路，介导TGF-β1发挥作用[3,4]。泛素蛋白酶体途径(UPP)可对细胞内蛋白进行特异性降解，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。Smad泛素化调节因子2(Smurf2)是泛素连接酶E3的一种，可通过泛素化降解Smad7调控TGF-β1信号传导，可能参与肺纤维化的发生发展[5,6]。2016年8月～2017年6月我们进行本研究，探讨Smurf2在肺纤维化发生、发展中的作用。

1　材料与方法

1.1材料健康清洁级SD雄性大鼠96只，8～10周龄，体质量(220±50)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(川)2015-030。博莱霉素(哈尔滨博莱制药有限公司)，兔抗大鼠TGF-β1、Smurf2、Smad7单克隆抗体(英国abcam公司)，DMSO溶液、MG132(上海碧云天生物技术有限公司)，Masson染色试剂(北京solarbio科技有限公司)，免疫组化试剂盒(武汉boster生物工程有限公司)。

1.2动物分组及处理将96只SD大鼠随机分为对照组、模型组、MG132组和DMSO组，每组24只。各组均采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露气管，模型组、MG132组、DMSO组制备肺纤维化模型：气管内一次性注入博莱霉素溶液0.3 mL(5 mg/kg)，然后将大鼠直立旋转使药液在肺内均匀分布；对照组一次性注入等量生理盐水。MG132组每天腹腔注射蛋白酶体抑制剂MG132 0.3 mL(0.1 mg/kg，以DMSO配制)，DMSO组每天腹腔注射等量DMSO，模型组及对照组每天腹腔注射等量生理盐水。

1.3相关指标观察①一般情况：各组于造模后第7、14、28天观察大鼠精神、食欲、毛色、活动度等一般情况。②肺组织病理学变化：各组于造模后第7、14、28天分别处死8只大鼠，开胸取出完整肺组织，肉眼观察肺组织；经主支气管向肺内注入10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋后切片。对切片进行Masson染色，观察组织病理学变化；使用ImagePro-Plus6.0图像分析系统对染色切片进行胶原纤维染色面积测评，以评价肺纤维化程度。肺纤维化程度的判断标准：轻度：肺纤维化面积占全肺面积<20%；中度：肺纤维化面积占全肺面积的20%～50%；重度：肺纤维化面积占全肺面积>50%。③肺组织TGF-β1、Smurf2、Smad7表达：取各组各时间点肺组织切片，采用免疫组化法检测TGF-β1、Smurf2、Smad7表达，步骤均参照试剂盒说明书。采用ImagePro-Plus6.0图像分析系统对免疫组化图片结果进行半定量分析，以积分光密度(IOD)值代表表达量。④肺组织Smurf2表达与胶原纤维染色面积、TGF-β1、Smad7表达的关系：采用Pearson相关分析法分析肺组织Smurf2表达与胶原纤维染色面积、TGF-β1、Smad7表达的关系。

2　结果

2.1各组一般情况比较造模后第7天各组精神、活动等一般情况均良好，组间差异不明显。造模后第14、28天：对照组一般情况均良好；模型组和DMSO组精神逐渐变差，呼吸逐渐困难，食量减少，体质量明显下降；MG132组精神、食欲、活动度等一般情况均介于对照组与模型组之间。

2.2各组肺组织病理学变化肉眼观察，对照组肺组织表面光滑、湿润，弹性尚可。模型组和DMSO组第7天双肺表面出现少量暗红色淤血、出血点，体积无变化；第14、28天双肺片状白色区域逐渐增多，肺体积逐渐缩小，弹性下降，表面凸凹不平。MG132组第7天双肺表面见少许暗红色淤血、出血区域，第14、28天双肺表面存在淤血、出血区及色泽苍白区，肺体积有所减小，弹性尚可，表面局部凸凹不平。

Masson染色结果显示，第7、14、28天对照组肺组织肺泡结构正常，未见明显蓝色胶原沉积。DMSO组及模型组第7天肺泡结构大体正常，少量蓝色胶原沉积；第14、28天肺泡结构破坏逐渐严重，蓝色胶原逐渐增加，较第7天增加明显。MG132组第7天肺泡结构大体正常，少量蓝色胶原沉积；第14、28天肺泡结构少许破坏，蓝色胶原略有增加，但较模型组有所减少。第7、14、28天模型组、MG132组和DMSO组肺组织Masson染色面积均逐渐增加，且均高于对照组，MG132组均低于模型组、DMSO组，组间比较P均<0.05。各时间点模型组和DMSO组间比较P均>0.05。见表1。

2.3各组肺组织TGF-β1、Smurf2、Smad7表达第7、14、28天模型组、MG132组和DMSO组肺组织TGF-β1、Smurf2表达的IOD值逐渐增加，且均高于对照组，MG132组均低于模型组、DMSO组，组间比较P均<0.05。第7、14、28天模型组、MG132组和DMSO组肺组织Smad7表达的IOD值逐渐降低，且均低于对照组，MG132组均高于模型组、DMSO组，组间比较P均<0.05。各时间点模型组和DMSO组肺组织TGF-β1、Smurf2、Smad7表达的IOD值比较P均>0.05。见表2。

表1　各组肺组织Masson染色面积比较

表2　　　　各组肺组织TGF-β1、Smurf2、Smad7表达比较

2.4肺组织Smurf2表达与胶原纤维染色面积、TGF-β1、Smad7表达的关系肺组织Smurf2表达与胶原纤维染色面积及TGF-β1表达均呈正相关(r分别为0.763、0.623，P均<0.05)，与Smad7表达呈负相关(r=-0.645，P<0.05)。

3　讨论

肺纤维化的病理特征主要为肺泡上皮细胞的炎症损伤、成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过度沉积和肺组织异常修复，最终导致结构和功能受损[2,7]。肺纤维化早期病理改变为肺泡炎，此后逐渐出现纤维化，造成不可逆性纤维化改变，导致肺功能逐渐下降，甚至呼吸衰竭[7，8]。TGF-β家族主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种类型，其中TGF-β1活性最强，功能最多，应用最广泛[9]。TGF-β1是多效性的细胞生长因子，通过促进细胞外基质沉积，在肺纤维化疾病的病理变化过程中发挥关键性作用[10～12]。Smad蛋白是近年发现的参与TGF-β细胞内传导的一类信号蛋白，是TGF-β受体下游的信号转导因子，建立起细胞膜与细胞核之间的信号转导通路，Smad蛋白是TGF-β信号传导通路中最关键的信号转导因子[13,14]。TGF-β1信号传导通路发挥效应时大部分需要下游Smad蛋白参与，Smad蛋白是其目的转录基因的主要信号传导蛋白，从而建立起胞膜与胞核之间的信号转导通路[3]。TGF-β1通过调控下游的Smad蛋白，诱导细胞外基质各种成分的合成，在肺纤维化的发生发展中具有关键作用，是诱导肺纤维化发生发展的关键细胞因子[12]。

泛素蛋白酶体途径(UPP)是对细胞内蛋白进行特异性降解的主要途径，是真核细胞内重要的蛋白质降解系统，参与细胞凋亡、细胞周期、细胞信号传导及抗原提呈等多种生理过程，对维持细胞稳态具有重要意义[5,15]。泛素活化过程包括泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。泛素连接酶E3能促使泛素与特异性蛋白结合，决定泛素底物蛋白的特异性及高选择性，Smurf是泛素连接酶E3中的一种，包括Smurf1、Smurf2。Smurf1与Smurf2在蛋白序列及结构上极其相似，但功能上存在许多不同。Smurf1主要参与负调控骨形态发生蛋白(BMP)信号传导，Smurf2主要通过选择性降解TGF-β1/Smad信号通路中的关键组分，其与受体活化性Smad相比，更易于与抑制性Smad结合，使Smad7蛋白泛素化降解，进而调控TGF-β1信号传导，导致TGF-β1信号通路异常，促进纤维化的发生发展[5,6,16，17]。

MG132是一种醛基肽类蛋白酶体抑制剂，能与蛋白酶体结合可逆性抑制蛋白酶体活性，从而抑制、阻断UPP。杨俊侠等[11]研究发现，TGF-β1可上调人肺成纤维细胞中Smurf2表达，而对Smurf1表达无影响。叶燕青等[18]研究发现，MG132能减轻博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型的纤维化程度，但机制不明确。本研究结果显示，模型组、DMSO组及MG132组肺组织纤维化程度、Smurf2及TGF-β1表达均逐渐增加，Smad7表达逐渐减少；与模型组及DMSO组相比，MG132组肺纤维化程度减轻，Smurf2及TGF-β1表达下调，Smad7表达上调。肺组织Smurf2表达与胶原纤维染色面积、TGF-β1表达呈正相关，Smurf2与Smad7表达呈负相关。提示采用MG132抑制Smurf2表达可阻止TGF-β1/Smad7信号传导，抑制肺纤维化的发生、发展。

综上所述，肺纤维化大鼠肺组织中Smurf2表达增加，并通过调控TGF-β1/Smad7信号传导促进肺纤维化的发生、发展。Smurf2有可能成为防止肺纤维化发生、发展的一个新靶点。

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