膀胱癌组织某一特异性EST片段全长扩增及生物信息学分析

赵振理，胡少华，郝川，史舒，任来成

(1 海南省妇幼保健院，海口570100；2山西医科大学第二医院)

膀胱癌的发生与基因突变及基因异常表达有关。为了从基因水平对膀胱癌进行研究，临床需要对差异表达基因进行分离、克隆和序列分析[1，2]。本课题组前期应用抑制消减杂交技术(SSH)从膀胱癌组织中获得一条类似表达细胞角蛋白20(CK20)基因的特异性表达序列标签(EST)片段，该EST片段具有较大的特异性，并且变异程度高，但其在膀胱癌发生发展中的作用尚不清楚[3]。2014～2016年，本研究对该EST片段进行全长扩增及生物信息学分析。现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料膀胱癌组织取自1例于山西医科大学第二医院泌尿外科行手术治疗的膀胱癌患者，患者为男性，65岁；术后病理证实为移行细胞癌，临床分期为T3期，临床分级为G2～G3级。主要试剂：DNA片段玻璃奶纯化回收试剂盒(北京博大泰克生物公司)；cDNA RACE扩增试剂盒(BD SMART RACE cDNA Amplification，KitClontech公司)。主要仪器：PCR扩增仪(2400，美国PE公司)，DNA测序仪(ABI377，美国PE公司)，DEPC(美国Sigma公司)，电泳槽(东方仪器厂)，台式离心机(北京市六一仪器厂)，紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.2膀胱癌组织变异EST片段的提取及全长扩增①总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法提取膀胱癌组织总RNA。取1 g膀胱癌新鲜组织进行冰浴，剪碎膀胱癌组织后加入少许变性液，低温研磨；依次加入2 mol/L的 NaAc(pH值为4.0)1.0 mL、水饱和酚10 mL、氯仿:异戊醇(49∶1)2 mL；将其冰浴15 min后在12 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，弃上清液；再次加入相同量的变性液、NaAc、水饱和酚、氯仿:异戊醇进行混匀，相同条件下离心15 min；提取上清液，加入等量异丙醇进行混匀并沉淀2 h，离心后弃上清；75%冷乙醇进行混匀，离心10 min；负压晾干后加入适量无RNA酶进行溶解，-20 ℃条件下保存。② mRNA定性定量分析：对提取的总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，并利用分光光度计检测mRNA在260 nm和280 nm的光密度(OD)值。③引物设计：根据该特异性EST片段的序列设计5′和3′特异性引物及巢式引物，引物长度27～28 bp。利用SMART (Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript)和RACE(Rapid Amplificationof cDNA Ends)技术克隆该特异性EST片段的全长。④巢式PCR产物鉴定：采用琼脂糖电泳法。利用玻璃奶快速纯化回收试剂盒回收DNA片段；电泳分离待回收DNA片段，将需要的DNA片段从琼脂糖凝胶上切下后放入1.5 mL Eppendorf管内；向Eppendorf管内加入适量溶胶液后在室温条件下放置5 min；加入10 μL玻璃奶进行混匀，12 000 r/min离心30 s，弃上清液；加入20 μL洗脱缓冲液混匀，水浴后进行离心，回收上清备用。⑤回收DNA测序：采用GeneTool软件合成RACE测序结果。

1.3EST片段的生物信息学分析①利用NCBI提供的开放阅读框(ORF) Finder程序，将获得的特异性EST片段通过RACE合成的DNA结果输入ORF Finder程序对话框，搜索其读码框(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。②利用NCBI提供的Forward e-PCR程序，将所获得的EST片段通过RACE合成的DNA结果输入上述程序对话框，获得染色体的DNA定位Marker，将该DNA定位Marker连接到DNA定位图谱，进行染色体DNA定位，在NCBI提供的Gene数据库中搜索与DNA定位Marker对应的基因定位(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/forward.cgi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。③利用NCBI提供的Blastn程序，在对话框中输入RACE合成的DNA结果并选择human EST，搜索与之最为匹配的EST序列，从而进一步确定该cDNA归属的UNGENE(网址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)。④利用Primer5.0软件，将ORF的DNA序列输入对话框，点击DNA→PRO按钮，软件将自动生成氨基酸序列。将自动生成的氨基酸序列输入NCBI提供的Blastp对话框，点击BLAST按钮，获得与之最为匹配的氨基酸序列，并结合NCBI提供的tblastn程序，分析其蛋白的具体归属情况(网址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn)。⑤利用瑞士生物信息院提供的蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System)ExPASY-ProtParam Tool，分析ORF翻译的多肽序列，可以获得其蛋白性质相关信息(网址http://web.expasy.org/protparam/)。⑥将ORF翻译的多肽序列输入Signal P 3.0 Serve软件对话框，分析蛋白的信号肽、裂隙结构及锚定结构等信息(网址http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。⑦利用Sequin软件编辑上述结果，上报NCBI GenBank，经校对认可后，获得GenBank accession number(E-mail: gb-admin@ncbi.nlm.nih.gov)。

2　结果

2.1特异性EST片段的全长扩增结果5′测序结果和3′测序结果整合后全长1 839 bp，即GeneBank中基因号为KR780251序列，全长序列见图1。

2.2cDNA读码框NCBI提供的ORF Finder程序发现，该cDNA在17～19位有起始密码子ATG，1 286～1 288位有终止密码子TGA，其读码框见图2。

2.3DNA定位MARKER结果NCBI提供的e-PCR程序进行DNA定位结果显示，其MARKER为RH12536，位于17号染色体410 327～414 666 bp处，与C17orf97基因处于同一位置，位于17p13.3。

图1　特异性EST片段全长扩增结果

图2　特异性EST片段cDNA读码框

2.4染色体DNA定位结果根据DNA定位Marker连接到DNA图谱，在NCBI提供的Gene数据库中进行搜索，其与C17orf97基因处于同一位置。

2.5核酸比对cDNA归属结果利用NCBI提供的blastn进一步确定RACE合成cDNA归属，与C17orf97基因位置相同。

2.6开放阅读框架翻译多肽序列利用Primer5程序将ORF翻译为多肽序列，结果见图3。

图3　开放阅读框架翻译多肽序列

2.7多肽序列分析结果利用NCBI提供的blastp、tblastn，ExPASY-ProtParam Tool进行分析，发现该蛋白由423个氨基酸构成，分子量为46 413.3 bp，等电点为8.61。

2.8蛋白分析结果SignalP 3.0分析结构结果显示，该蛋白为跨膜蛋白和信号肽的可能性不大，裂隙结构在31～32位氨基酸位置的可能性最大。

2.9NCBI GenBank校对结果该序列在GeneBank获得基因号为KR780251，ORF翻译的多肽序列获得蛋白ID为AKO62675。

3　讨论

近年来，从基因水平对膀胱癌进行研究逐渐成为热点[4～6]。SSH能够克隆低丰度的差异表达基因，且敏感性及特异性均较高，被广泛用于差异表达基因的分离、克隆和序列分析[7]。Adams等[8]于1991年提出EST技术，用于寻找并定位人类新基因。EST技术从提出到现在，已经帮助人们发现了大量的新基因，充分证明该技术的有效性[9]。为了从基因水平对膀胱癌的发病机制进行研究，本课题组前期利用SSH对膀胱癌组织与正常膀胱黏膜组织进行对比分析，获得上百条EST片段；其中绝大部分是已知片段，但有一条片段具有较大的特异性，其变异程度高，经网上比对，发现为一条类似表达CK20基因的片段。CK20是Moll等[10]在1990年首次分离出的一种角蛋白，含有424个氨基酸，在胃肠道上皮细胞、默克尔细胞和尿路上皮细胞等均有表达，而正常尿路上皮细胞不表达，与膀胱癌的复发及转移密切相关[11～14]。为了明确变异EST片段在膀胱癌中的作用，本研究通过RACE扩增技术对此EST片段进行扩增得到cDNA全长序列，分析发现读码框完整，为下一步的生物信息学研究提供了较好的基础。

通过对ORF翻译多肽序列进行分析，发现该序列全长有423个氨基酸，而CK20有424个氨基酸，因此该序列与CK20不同。通过NCBI提供的BLASTN及BLASTP等程序进行分析发现，本研究获得的多肽序列与Strausberg等[15]发现的序列具有高度相似性，他们向NCBI申请将其命名为C17orf97，但未进一步对此段多肽序列进行研究。Brower等[16]首先在小鼠中发现上述序列，并向NCBI的GenBank提交此序列获得基因号LIAT1，后期研究发现在人体中也存在该序列。LIAT1基因位于端粒的近端区域，此区域易导致基因的不稳定性，其可促进人精胺酰基转移酶1(ATE1)的精胺酰化过程，以此促进相关蛋白降解。该段多肽序列中具有一段重复性的氨基酸序列，并且在不同的生物中其重复次数不同，因此Brower等[16]提出此段氨基酸序列的重复次数可能与生物进化有关。本研究检索发现尚未有关于LIAT1(又称为C17orf97)在膀胱癌中的表达情况的相关研究，因此利用sequin软件向NCBI GenBank提交申请并获得基因号KR780251和蛋白ID为AKO62675。

综上所述，该膀胱癌组织特异性EST片段全长序列KR780251有1 839 bp，含有完整的ORF，KR780251编码的蛋白AKO62675可能是正常膀胱组织基因的突变体编码所得，但相关机制需要进一步研究。

参考文献：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] 胡少华,赵振理.膀胱移行细胞癌差异基因的克隆[J].中国药物与临床,2016,16(5):648-650.

[4] 韩冬,刘成华.高亚萍,等.膀胱癌相关基因的筛选及初步验证[J].解放军医学院学报,2017,38(4):323-327,341.

[5] 叶真逢,胡红林,习小庆.survivin单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的关系探讨[J].山东医药,2012,52(14):70-71.

[6] Xie D, Zhang H, Hu X, et al. Knockdown of long non-coding RNA taurine up-regulated 1 inhibited doxorubicin resistance of bladder urothelial carcinoma via Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2017,8(51):88689-88696.

[7] Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93(12):6025-6030.

[8] Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, et al. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project[J]. Science, 1991,252(5013):1651-1656.

[9] 王正晖,韦淑萍,解宏伟,等.多种高通量表达谱数据分析方法筛选大肠癌相关基因[J].武警后勤学院学报(医学版),2015,24(2):97-99.

[10] Moll R, Schiller DL, Franke WW. Identification of protein IT of the intestinal cytoskeleton as a novel type I cytokeratin with unusual properties and expression patterns[J]. J Cell Biol, 1990(111):567-580.

[11] 胡少华,赵振理.细胞角蛋白20在膀胱癌研究中的进展[J].临床医药实践,2015,24(8):611-613.

[12] Moll R, Lowe A, Laufer J, et al. Cytokeratin 20 in human carcinomas. A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies[J]. Am J Pathol, 1992,140(2):427-447.

[13] Abdul-Maksoud RS, Shalaby SM, Elsayed WS, et al. Fibroblast growth factor receptor 1 and cytokeratin 20 expressions and their relation to prognostic variables in bladder cancer[J]. Gene, 2016,591(2):320-326.

[14] Schmidt J, Propping C, Siow WY, et al. Diagnostic and prognostic value of bladder cancer-related transcript markers in urine[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2016,142(2):401-414.

[15] Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, et al. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(26):16899-16903.

[16] Brower CS, Rosen CE, Jones RH, et al. Liat1, an arginyltransferase-binding protein whose evolution among primates involved changes in the numbers of its 10-residue repeats[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014,111(46):E4936-4945.