花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D诱导内皮细胞凋亡的影响及作用机制

陈积雄，黄晓燕，林文婷，何扬利，符秀虹，曾敏，汪道文

(1 海南省人民医院，海口570030；2华中科技大学附属同济医院)

内皮细胞凋亡在心血管疾病的发生及发展过程中起重要作用，是冠心病、心力衰竭等疾病的始动因素[1]。花生四烯酸经表氧化酶代谢可生成多种环氧二十碳四烯酸(EET)，对维持心血管系统稳定至关重要[2,3]。研究证实，TNF-α可促进内皮细胞凋亡；EET可抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，但具体作用机制尚未阐明[4,5]。2016年5月～2017年5月，本研究观察了花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D(ActD)诱导内皮细胞凋亡的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料人脐静脉内皮细胞为本实验室冻存细胞株；内皮细胞培养液及生长因子、Annexin V-FITC试剂盒购自Life technologies。3-甲基腺嘌呤(3MA)、14,15-EET、微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)及微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)抗体、TNF-α、ActD购自Sigma公司；Caspse-8、Caspse-9活性检测试剂盒购自B&D公司。

1.2细胞培养采用含10% FBS的内皮细胞培养基培养人脐静脉内皮细胞，隔日换液，选用第4～5代细胞用于实验。将细胞随机分成空白组、模型组、EET组及EET+3MA组。空白组常规培养；模型组、EET组及EET+3MA组均加入TNF-α(10 ng/mL)和ActD(5 ng/mL)诱导凋亡；诱导凋亡的同时EET组加入14,15-EET(100 nmol/L)； EET+3MA组加入14,15-EET (100 nmol/L)、3MA(2 mmol/L)。各组培养24 h时进行以下研究。

1.3细胞凋亡检测采用流式细胞仪。将上述各组细胞给予胰蛋白酶-EDTA消化，收集细胞至10 mL离心管中，低速离心后弃培养液。采用缓冲液漂洗细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。取195 μL细胞悬液，加入PI和Annexin-v 5 μL，混匀后反应25 min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4LC3-Ⅰ、 LC3-Ⅱ蛋白表达检测采用Western blotting法。将上述各组细胞采用冰PBS 洗涤，加入100 μL三去污细胞裂解液冰上裂解20 min；采用Bradford法测定样品蛋白含量，调整蛋白浓度；取相同总量的蛋白样品，加入加样缓冲液，高温凝固蛋白，加样至SDS聚丙稀酰胺中，持续电泳直至染料到底部；4 ℃、25 V电压下转膜过夜；封闭液浸泡封闭膜2 h，采用TBS-T液洗膜4次；分别加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ一抗(工作液浓度均为1∶3 000)孵育过夜；采用TBS-T液洗脱，加入辣根过氧化物酶标记的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ二抗(工作液浓度均为1∶1 000)，室温孵育1 h；采用TBS-T液洗膜3次，采用ECL化学发光法显影。采用Quantity One 图像分析软件对蛋白电泳条带的灰度值定量分析，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.5Caspase-8、Caspase-9活性检测采用ELISA法。收集上述各组细胞，250 g离心10 min；加入裂解缓冲液，冰上孵育10 min；10 000 r/min离心1 min，收集上清；在酶标板中分别加入50 μL细胞裂解液、50 μL反应缓冲液、5 μL反应底物Caspase-8、Caspase-9；常温孵育1～2 h，采用酶标仪检测Caspase-8、Caspase-9活性，以光密度(OD)值表示。具体步骤参照Caspase-8、Caspase-9活性检测试剂盒说明书。

2　结果

2.1各组细胞凋亡率比较空白组、模型组、EET组及EET+3MA组细胞凋亡率分别为(0.22±0.11)%、(28.20±2.34)%、(8.23±1.14)%、(15.12±2.12)%，空白组、EET组及EET+3MA组细胞凋亡率均低于TNF-α组(P均<0.01)，EET+3MA组高于EET组(P<0.05)。

2.2各组细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较EET组及EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于模型组、空白组(P<0.05或<0.01)；EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于EET组(P<0.01)。见表1。

表1　　　　各组细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达

注：与空白组比较，#P<0.01；与TNF-α组比较，*P<0.05；与EET组比较，△P<0.01。

2.2各组细胞Caspase-8、Caspase-9活性比较模型组、EET组、EET+3MA组Caspase-8、Caspase-9活性均高于空白组，模型组高于EET+3MA组、EET组，EET+3MA组高于EET组，组间比较P<0.05或<0.01。见表2。

表2　各组细胞Caspase-8、Caspase-9活性比较

注：与空白组比较，#P<0.01；与TNF-α组比较，*P<0.05；与EET组比较，△P<0.01。

3　讨论

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。研究表明，自噬现象在内皮细胞中广泛存在，抑制内皮细胞自噬能够促进氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤[4]。Chen等[5]报道，白藜芦醇通过上调自噬，减少TNF-α诱导的内皮细胞损伤；说明自噬是内皮细胞存活及保持活力的自我调节方式之一，适度的自噬可能会保护内皮细胞，抑制细胞凋亡。

花生四烯酸是内皮细胞富含的一种物质。近年研究发现，花生四烯酸可通过细胞色素P450(CYP)表氧化酶代谢产生四种EET，分别为5,6、8,9、11,12和14,15-EET。EET通过上调内皮细胞内源性一氧化氮合酶表达，促进NO释放，发挥舒张血管、保护内皮的生物学功能[8,9]；采用CYP2J2转染或给予8,9-EET处理均可导致NF-κB、MMP-9表达下调，促进内皮细胞增殖和迁移，抑制主动脉平滑肌细胞增殖和迁移，发挥抗动脉粥样硬化的作用[10]。Dhanasekaran等[11]研究发现，心肌缺血处理20 min后应用11,12-EET、14,15-EET可显著缩小心肌梗死面积。上述研究提示，EET具有抑制内皮细胞凋亡及损伤，抑制平滑肌细胞增殖，保护心肌细胞等作用，对维持心血管系统稳定意义重大[2]。Yang等[3]在研究花生四烯酸抑制TNF-α诱导内皮细胞凋亡的过程中发现，花生四烯酸可能通过激活MAPK及PI3K/Akt等途径抗细胞凋亡；但抑制了MAPK及PI3K/Akt等途径并不能完全阻断花生四烯酸的这种抗凋亡作用，提示花生四烯酸抗凋亡仍可能存在其他机制。Samokhvalov等[12]证实，EET能上调自噬，抑制饥饿诱导的内皮凋亡，提示EET可能通过活化自噬途径发挥抗凋亡作用。

本研究采用联合TNF-α/ActD诱导的内皮细胞凋亡模型。TNF-α是内皮细胞凋亡研究中常用的诱导剂；ActD可抑制蛋白质或RNA合成，即抑制抗凋亡基因的表达；联合使用TNF-α/ActD能更好地诱导内皮细胞凋亡[13]。本研究结果显示，TNF-α/ActD诱导下内皮细胞出现了明显的凋亡，加入14,15-EET后内皮细胞凋亡减少，证实14,15-EET可抑制内皮细胞凋亡。研究发现，Beelinl/PI3K-Ⅲ复合体参与了自噬泡的形成和自噬的启动；而3MA可通过抑制PI3K-Ⅲ复合体形成阻滞自噬的发生[14]。证实3MA是一种常用的细胞自噬阻滞剂。本研究中EET+3MA组加入3MA处理后，14,15-EET的抗凋亡作用明显减弱，提示自噬可能在14,15-EET抗TNF-α诱导的内皮细胞凋亡中发挥作用。

Atg8是在酵母中发现的一种自噬发生必需的蛋白质分子[15]。LC3是哺乳动物中ATG8-PE共轭体的同源物，LC3-Ⅱ是细胞质中的LC3-Ⅰ经过剪切等处理后的功能片段，为自噬泡形成所必需，其含量与自噬水平相关。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ是反映哺乳动物自噬水平公认的指标[16]。本研究结果显示，在TNF-α诱导下内皮细胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，提示TNF-α诱导下内皮细胞发生自噬，可能是内皮细胞对外界损伤的一种保护机制。加入14,15-EET后，LC3-Ⅱ表达升高，进一步说明14,15-EET促进自噬。3MA、14,15-EET同时处理的内皮细胞LC3-Ⅱ表达明显抑制，说明14,15-EET诱导的自噬参与了抗凋亡作用。提示内皮细胞通过激活自噬对抗外源性损伤。

尽管认为自噬与凋亡在形态学、发生机制等多个方面均存在不同，但越来越多的研究提示,自噬与凋亡二者之间相互联系及制约，其中关于Caspase家族与两者关联的研究最为广泛。有研究者利用RNA干扰技术下调Caspase-8表达以抑制细胞凋亡的发生，但是相比未干扰细胞，干扰细胞中出现了更多的自噬小体，说明RNA干扰技术抑制Caspase-8表达的同时激活了自噬途径[17]。Furuya等[18]发现自噬关键蛋白Beclin-1可通过提高Caspase-9活性而增加凋亡诱导剂引起的细胞凋亡，提示Caspase在自噬与凋亡交互作用中发挥重要作用。本研究TNF-α组细胞凋亡显著增加的同时，Caspase-8、Caspase-9活性均明显升高，提示二者在TNF-α诱导细胞凋亡中发挥作用。加入14,15-EET后二者活性明显下降，说明14,15-EET可能通过抑制Caspase-8、Caspase-9发挥抗凋亡作用。EET+3MA组同时给予14,15-EET和3MA可抑制细胞自噬，Caspase-8、Caspase-9活性再次明显升高，说明14,15-EET上调自噬的机制可能是抑制Caspase-8、Caspase-9活性。

综上所述，花生四烯酸可抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡；通过抑制Caspase-8、Caspase-9活性诱导自噬可能是其作用机制。

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