α-乳香酸灌胃对小鼠肾间质纤维化的防治作用及其机制探讨

柳敏娜，刘天龙，刘利敏，杨振，段梦露，孙世仁

(第四军医大学西京医院，西安710032)

肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病进展到终末期的共同病理过程[1]。相比肾小球及肾脏血管疾病，间质纤维化在肾单位功能损失中扮演重要角色[2]。转化生长因子β1(TGF-β1)被认为是关键的促纤维化细胞因子，其主要通过激活下游Smad家族蛋白表达从而调控细胞外基质产生。因此，抑制TGF-β/Smad通路有助于缓解肾间质纤维化，保护肾功能[3]。大量研究[4,5]表明，中药及其有效成分可通过抑制该通路发挥抗肾纤维化作用，延缓肾脏疾病进展。α-乳香酸是乳香药材经过提取、分离、纯化后的产物。前期研究发现，乳香酸可以通过抑制TGF-β/Smad通路逆转血管纤维化[6]，提示乳香酸有潜在的抗肾纤维化作用。本研究分别以小鼠单侧输尿管结扎、肾小管上皮细胞缺氧处理模拟肾脏纤维化动物模型和细胞模型，观察α-乳香酸对肾间质纤维化的防治作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞与主要材料 SPF级C57/BL雄性小鼠52只由第四军医大学实验动物中心提供。人肾小管上皮细胞HK-2购自美国ATCC细胞库。α-乳香酸(纯度≥98%、批号20150306)购自宝鸡辰光生物有限公司。尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(t-SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白定量试剂盒购自西安飞扬生物科技有限公司。兔抗α-SMA抗体、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗TGF-β1、Smad2/3和Smad7抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司。

1.2 α-乳香酸对小鼠肾间质纤维化的防治作用观察

1.2.1 肾间质纤维化诱导及α-乳香酸给药方法 小鼠适应性喂养2周后，随机分为假手术组、模型组和乳香酸组，每组14只。模型组和乳香酸组参照文献[7]方法行单侧输尿管结扎(UUO)手术诱导肾间质纤维化：小鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，仰卧位固定，从左下侧腹部纵切打开腹腔，分离左侧输尿管后在中段位置结扎，缝合腹腔。假手术组只分离输尿管但不结扎，其余操作与模型组一致。造模后第1天乳香酸组用α-乳香酸60 mg/kg灌胃，连续给药21 d。

1.2.2 血清肾功能相关指标检测 给药结束后麻醉大鼠，摘眼球取血。血液在常温下3 000 r/min离心10 min获得血清。根据试剂盒说明书检测血清BUN、Scr、MDA和t-SOD。

1.2.3 肾脏组织病理观察 小鼠麻醉后，先后用生理盐水和4%多聚甲醛灌注固定，取左侧肾脏，放入4%多聚甲醛继续固定48 h。随后进行石蜡包埋、5 μm厚切片。各组组织切片分别进行HE染色和MASSON染色。参考文献[8]进行肾小管间质损伤评分和间质纤维化评分。

1.2.4 肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白检测 取各组小鼠肾脏组织，提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE电泳胶分离蛋白，每个孔上样量为10 μg。将胶上的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用抗TGF-β1抗体(1∶1 000)、α-SMA抗体(1∶1 000)、Smad2/3抗体(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜。二抗在室温下孵育1 h，洗涤后用ECL发光液发光，用BIO-RAD凝胶成像分析系统进行曝光采集，用Image J软件分析蛋白相对表达量。小鼠肾脏组织中的总RNA根据QIAGEN RNeasy Mini试剂盒操作说明提取。引物由Primer5.0软件设计。TGF-β1上游引物序列为5′-TGGCCAGATCCTGTCCAAAC-3′，下游引物序列为5′-GCGGGTGACCTCTTTAGCAT-3′；Smad2上游引物序列为5′-TCGGCACACGGAGATTCTAAC-3′，下游引物序列为5′-ACCAGAATGCAGGTTCCGAG-3′；Smad3上游引物序列为5′-CCGTGGAACTTACAAGGCGAC-3′，下游引物序列为5′-GGCAGCAAATTCCTGGTTGT-3′；Smad7上游引物序列为5′-TCTCAAACCAACTGGCTGTCC-3′，下游引物序列为5′-AGAGCCTCCCCACGCGA-3′；α-SMA上游引物序列为5′-GTTTCTCGCACGTCTCCTCT-3′，下游引物序列为5′-CAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′；内参GAPDH上游引物序列为5′-AGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′，下游引物序列为5′-ATGGGCTTCCCGTTGATGAC-3′。PCR反应条件为：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火31 s，72 ℃延伸40 s。共进行40个反应。

1.3 α-乳香酸对HK-2细胞的抗纤维化作用观察 HK-2细胞复苏后，在DMEM培养基中常规培养，培养条件为37 ℃、21% O2、5% CO2。将HK-2细胞分为对照组、实验1组、实验2组。实验1、2组放入三气培养箱中(37 ℃、1% O2、5% CO2)培养48 h。实验2组缺氧处理前在培养基中加入25 μg/mL的α-乳香酸。培养48 h后采用Western blotting法检测各组细胞中的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白，方法参考“1.2.4”。

2 结果

2.1 α-乳香酸对小鼠肾间质纤维化的防治作用

2.1.1 各组小鼠血清BUN、Scr、MDA水平比较 模型组小鼠血清BUN、Scr、MDA水平高于假手术组，SOD水平低于假手术组(P均<0.01)。乳香酸组小鼠血清BUN、Scr、MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠血清BUN、Scr、SOD、MDA水平比较

注：与假手术组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05；与模型组相比，##P<0.01。

2.1.2 各组小鼠肾脏组织病理变化 HE结果显示，假手术组小鼠肾脏组织未见明显病理改变。模型组肾小管上皮细胞萎缩、排列错乱，正常结构消失，肾小球硬化，肾小管管腔扩张，间质纤维组织增生，有明显炎症细胞浸润。模型组、假手术组、乳香酸组肾小管间质损伤评分分别为(8.66±1.22)、(0.65±0.18)、(5.21±1.03)分，模型组肾小管间质损伤评分高于假手术组，乳香酸组低于模型组(P均<0.05)。MASSON染色结果显示，假手术组小鼠肾小管上皮细胞排列整齐，胶原染色主要集中在小管基底膜、肾小球系膜及毛细血管周围，小管周围间质无染色。模型组肾小管间质可见大量蓝色胶原沉积，间质纤维组织增生；乳香酸组肾小管间质纤维化程度较模型组明显减轻。模型组、假手术组、乳香酸组间质纤维化评分分别为(2.98±0.43)、(0.26±0.13)、(1.74±0.27)分，模型组间质纤维化评分高于假手术组，乳香酸组间质纤维化评分低于模型组(P均<0.05)。详见图1。

注：A为HE染色结果；B为MASSON染色结果。

图1各组小鼠肾脏组织病理变化

2.1.3 各组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白表达比较 模型组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量高于假手术组，Smad7 mRNA及蛋白相对表达量低于假手术组(P均<0.05)。乳香酸组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量低于模型组，Smad7 mRNA及蛋白相对表达量高于模型组(P均<0.05)。见图2、表2。

2.2 α-乳香酸对HK-2细胞的抗纤维化作用 实验1组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相对表达量高于对照组，Smad7相对表达量低于对照组(P均<0.05)；实验2组TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相对表达量低于实验1组，Smad7相对表达量高于实验1组(P均<0.05)。见图3、表3。

3 讨论

肾间质纤维化是导致终末期肾病的主要病理机制，可进展为肾衰竭而危及生命[9]。近年来，中药在肾间质纤维化的治疗上效果显著。前期研究表明，乳香酸有很好的抗纤维化作用[6]，但乳香酸对肾间质纤维化的治疗作用未见报道。本文拟对乳香酸的主要成分之一α-乳香酸对肾脏纤维化的防治作用进行研究，并进一步探讨机制。预实验首先确定了α-乳香酸对小鼠和HK-2细胞抗肾脏纤维化的最佳药物浓度分别为60 mg/kg和25 μg/mL。

图2 各组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表达情况

图3 各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表达情况

组别TGF⁃β1mRNA蛋白Smad2mRNA蛋白Smad3mRNA蛋白Smad7mRNA蛋白α⁃SMAmRNA蛋白假手术组1．01±0．280．92±0．091．07±0．171．03±0．141．04±0．210．99±0．181．11±0．141．02±0．180．95±0．221．09±0．23模型组4．51±0．99∗∗3．77±1．05∗∗2．84±0．38∗1．96±0．22∗2．86±0．75∗3．55±1．01∗∗0．54±0．19∗0．36±0．12∗∗3．17±0．62∗∗2．99±0．43∗∗乳香酸组2．91±0．47#1．84±0．32#1．77±0．32#1．37±0．18#1．79±0．24#2．71±0．63#0．85±0．14#0．69±0．13#1．89±0．35#1．60±0．26##

注：与假手术组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

表3 各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与实验1组相比，#P<0.05。

我们先观察了α-乳香酸对小鼠肾间质纤维化的防治作用。Scr和BUN是反映肾功能的常用指标，二者水平增高与肾脏疾病进展呈正相关[10]。当体内MDA水平增高、SOD活性下降时，机体氧化应激增强，而抗氧化能力减弱，最终导致肾组织损伤。本研究结果显示，模型小鼠在输尿管结扎手术21 d后，血清Scr、BUN水平显著升高，表明手术成功诱导了小鼠肾功能损伤；同时血清MDA水平增高、SOD活力降低，表明造模后小鼠体内氧化应激水平升高。而乳香酸组小鼠经α-乳香酸治疗后，血清Scr、BUN、MDA水平降低，SOD活力增高，提示α-乳香酸具有肾保护作用。同时，各组小鼠肾脏组织病理检查结果显示，模型组小鼠肾小管变形，可见明显水肿和炎症细胞浸润，间质周围胶原沉积显著，表明模型组小鼠发生肾纤维化病理改变。而给予α-乳香酸灌胃后，肾脏病理结构变化有显著改善，肾小管间质损伤和间质纤维化程度减轻，表明α-乳香酸有抗肾脏纤维化的作用。

为了进一步探究α-乳香酸抗纤维化的作用机制，我们观察了各组小鼠肾脏组织中纤维化相关分子的表达变化。TGF-β1参与诱导肾脏纤维化的多个环节，是重要的促纤维化因子[11]。活化的TGF-β1可调控细胞分化、增殖、迁移及细胞外基质表达。大量研究表明，在与间质纤维化相关的肾脏疾病中，TGF-β1表达都显著升高[12,13]。而抑制TGF-β1的生物活性可减缓纤维化进程[14]。本研究中，模型组肾脏组织中TGF-β1mRNA及蛋白表达水平升高，给药后显著下降，提示α-乳香酸可通过抑制TGF-β1的表达起到抗肾脏纤维化的作用。

Smad家族是TGF-β诱导的纤维化过程中关键的下游调节因子，在TGF-β的刺激下，Smad2和Smad3发生磷酸化，进入核内调控靶基因转录[15]。研究表明，慢性肾脏病样本中Smad2、Smad3水平较正常组织高[16]，抑制二者表达可有效缓解纤维化[17]。Smad7是一种抑制型Smad蛋白，通过负反馈调节TGF-β1，抑制Smad2和Smad3的磷酸化。Smad7的过表达可抑制TGF-β/Smad通路，延缓肾脏纤维化的进展[18]。α-SMA是肌成纤维细胞的特征分子，在TGF-β的刺激下，α-SMA表达升高，成纤维细胞大量增生[19]。本研究结果显示，模型组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量高于假手术组，Smad7 mRNA及蛋白相对表达量低于假手术组；乳香酸组小鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量低于模型组，Smad7 mRNA及蛋白相对表达量高于模型组。这提示α-乳香酸可阻断TGF-β/Smad通路激活，进而发挥抗肾纤维化作用。

肾小管间质慢性缺氧是促进各种慢性肾脏病进展至终末期的共同机制[20]。HK-2细胞缺氧处理是体外模拟肾间质纤维化的经典方法[21]。在本实验中，HK-2细胞经过缺氧处理后，细胞内α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、表达升高，Smad7表达下调，给予α-乳香酸处理后，这些蛋白表达发生逆转，与小鼠体内实验结果一致。上述结果表明α-乳香酸对肾纤维化的防治作用可能是通过下调TGF-β1、α-SMA表达和抑制Smad2、Smad3活化来实现的。

综上所述，α-乳香酸对小鼠肾间质纤维化有防治作用，机制可能与抑制TGF-β/Smad通路有关。

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