miR-381在肾癌细胞中的表达变化及其对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

梁颖莹，莫志文，黄宇帆，邵汛帆，袁亚维

(广州医科大学附属肿瘤医院，广州510030)

肾细胞癌(肾癌)是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一[1]。肾癌治疗方法包括手术及免疫治疗，但复发和转移仍是威胁患者生命的重要原因，进展期患者5年生存率不到10%[2]。因此，深入研究肾癌发病机制，对提高肾癌诊治水平具有重要意义。miRNA不编码蛋白质，可通过与靶标基因3′-UTR端的序列结合从而沉默基因表达[3]。现已发现多种肿瘤中miRNA表达异常，且miRNA可通过影响细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡从而参与肿瘤的发生发展[4]。研究[5,6]认为miRNA可作为多种肿瘤的临床诊断、病理分型和预后的标志物。miR-381位于人14号染色体上，在多种肿瘤中表达下调，对肿瘤细胞的生长侵袭有抑制作用。有学者[7～9]报道miR-381可通过抑制ERK和AKT信号通路促进神经胶质瘤细胞增殖，其表达水平也与肺癌的预后不良呈负相关。关于miR-381在肾癌中的作用尚未见报道。本研究观察了miR-381在肾癌细胞系中的表达变化，及其对肾癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 肾癌细胞系Caki-2、A498、786-O及人正常肾上皮细胞系HK-2均购自中山大学实验动物中心细胞库。胎牛血清及RPMI1640培养基购自美国Roswell公司。DNA结合抑制因子1(ID-1)及GAPDH一抗均购自美国BD公司，二抗购自美国Santa Cruz公司。miR-381 mimics及Scramble均由上海吉玛生物科技有限公司合成。RT-PCR仪购自美国BD公司。HBS-1096B酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司。蛋白免疫印迹电泳设备购自美国Bio-Rad公司。

1.2 肾癌细胞中miR-381检测 Caki-2、A498、786-O细胞及HK-2细胞均种植于RPMI1640培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，48 h后消化传代。采用qRT-PCR法检测各细胞中的miR-381，以U6小核RNA作为内参，以2-ΔΔCt表示miR-381相对表达量。

1.3 miR-381表达变化后细胞增殖、迁移、侵袭能力观察

1.3.1 Caki-2细胞分组及miR-381 mimics转染方法 将Caki-2细胞分为miR-381组、NC组、mock组，miR-381组采用LipofectamineTM2000转染miR-381 mimics，mock组转染miR-381 Scramble，NC组不做转染处理。miR-381 mimics上游引物序列为5′-UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU-3′，下游引物序列为5′-AGAGAGCUUGCCCUUGUAUAUU-3′。miR-381 Scramble上游引物序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。采用qRT-PCR法检测各组细胞中的miR-381，miR-381组、NC组、mock组中miR-381相对表达量分别为8.950±0.720、1.000±0.003、1.090±0.050，miR-381组miR-381相对表达量高于mock组和NC组(P均<0.05)。提示转染成功，可进行下一步实验。

1.3.2 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将miR-381组、NC组及mock组细胞消化成单细胞悬液后，以2×103个/孔将种植于96孔板上，每孔培养基体积200 μL，分别于培养0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，继续培养1 h，在450 nm波长下用酶标仪测定各孔光密度值(OD值)，以此表示细胞增殖能力。以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.3.3 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。将miR-381组、NC组、mock组细胞接种于6孔板，培养24 h后用胰蛋白酶消化，待细胞长满培养板后，用200 μL的Tips枪头沿培养板划直线，分别于划痕后即刻和划痕后48 h计算划痕面积和划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕后即刻划痕面积-划痕后48 h划痕面积)/划痕后即刻划痕面积×100%。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。取miR-381组、NC组、mock组2×104个细胞，接种于碳酸磷脂表面，于37 ℃下培养24 h，用1%多聚甲醛与膜下面的细胞结合，哈里斯苏木精溶液染色，在高倍镜(200×)下随机取10个视野，计算穿膜细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.3.5 各组细胞中ID-1 mRNA及蛋白检测 细胞转染72 h后提取mRNA及蛋白，采用qRT-PCR法检测各组细胞中的ID-1 mRNA。采用Western blotting法检测各组细胞中的ID-1蛋白。将miR-381组、NC组、mock组细胞裂解、变性，每孔30 μg蛋白上样。浓缩胶条件为50 min、80 V，分离胶条件为100 min、100 V，常规转膜，加入ID-1及GAPDH一抗，浓度为1∶200，4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育4 h，PBST漂洗后ECL液显影。采用Quantity One 1-D软件分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 肾癌细胞中miR-381表达变化 Caki-2、A498、786-O细胞中miR-381相对表达量分别为0.290±0.030、0.370±0.040、0.51±0.043，HK-2细胞中miR-381相对表达量为1.00±0.04。Caki-2、A498、786-O细胞中miR-381相对表达量低于HK-2细胞(P均<0.01)。

2.2 各组Caki-2细胞增殖能力比较 转染72、96 h后miR-381组细胞增殖能力低于NC组、mock组(P均<0.05)。详见表1。

表1 转染后不同时间三组Caki-2细胞OD值比较

2.3 各组Caki-2细胞迁移、侵袭能力比较 miR-381组、mock组、NC组细胞划痕愈合率分别为28.7%±2.6%、59.7%±4.8%、56.4%±4.5%，侵袭细胞数分别为(44.7±3.9)、(235.9±17.9)、(225.7±15.7)个，miR-381组细胞划痕愈合率及侵袭细胞数均少于mock组、NC组(P均<0.01)。详见图1A、图1B。

注：A为细胞划痕实验结果；B为Transwell实验结果。

图1各组细胞迁移、侵袭能力情况

2.4 各组Caki-2细胞中ID-1 mRNA及蛋白表达比较 miR-381组、mock组、NC组细胞中ID-1 mRNA相对表达量分别为0.38±0.04、1.08±0.09、1.0±0.06，ID-1蛋白相对表达量分别为0.45±0.04、1.11± 0.08、1.0±0.09，miR-381组细胞中ID-1 mRNA及蛋白相对表达量均低于mock组、NC组(P均<0.01)。

3. 讨论

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，发病率占泌尿系统肿瘤的第二位[1]。肾癌目前常用的治疗方法包括手术和放化疗，但疗效不理想，因此，寻找合适的早期生物标志物成为研究重点。研究发现多个miRNA异常表达(如miR-34a，miR-141、miR-142-3p、miR-21、miR-155、miR-210)对肾癌细胞发生发展起重要调控作用[10～12]。

miR-381的编码序列位于14号染色体上，已证实与细胞增殖、分化有关。在脑肿瘤中，miR-381可作为重要的血清诊断标志物及预后标志物。此外，miR-381可以通过抑制C/EBP依赖性的CX43表达而参与乳腺癌的侵袭和转移过程，通过调控p53/PTTG1通路从而促进垂体肿瘤发生，并可通过抑制SOX4促进胃癌细胞的转移[8，12]。陈兵海等[7]报道，在肾细胞癌中miR-381呈显著低表达。本研究选取三个肾细胞癌细胞系，发现相对于人正常肾上皮细胞系HK-2，Caki-2、A498、786-O细胞中miR-381相对表达量降低，与上述研究结果一致。为研究miR-381在肾癌发生发展中的作用，我们上调了Caki-2细胞中miR-381的表达，结果显示转染72、96 h后miR-381组细胞增殖能力低于NC组、mock组，miR-381组细胞划痕愈合率及侵袭细胞数均少于mock组、NC组。这说明miR-381过表达后，Caki-2细胞的增殖、迁移、侵袭能力受到抑制，推测miR-381起到了抑癌基因作用。

研究[13]发现，miR-381可靶向结合ID-1，并确认ID-1为miR-381的靶标分子。ID家族成员的3′非编码区可能存在一个能够与miR-381相结合的区域，提示异常高表达的miR-381可能通过对ID的靶向调控从而参与早期癌变过程。ID-1是螺旋-环-螺旋转录因子家族成员之一，可通过抑制转录因子与DNA的结合，其表达一旦失调，会导致肿瘤的发生[14]。ID-1主要功能是促进细胞增殖，并抑制细胞分化，诱导血管形成，与肿瘤进展及预后相关[15]。目前研究认为，ID-1主要是通过调控细胞周期来影响细胞增殖、分化的。在正常组织中，ID-1蛋白表达水平较低甚至不表达；而在恶性肿瘤中，如前列腺癌、膀胱癌、食道癌等组织中均可检测到ID-1高表达[16～18]。故有学者[18～20]认为ID-1是肿瘤诊断及预后标志物。为探讨miR-381参与肾癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制，我们进一步检测了三组细胞中的ID-1 mRNA及蛋白，结果显示，miR-381组细胞中ID-1 mRNA及蛋白相对表达量均低于mock组、NC组，提示miR-381能够通过作用于ID-1来发挥抑癌作用，抑制肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。

综上所述，肾癌细胞中miR-381呈低表达；过表达miR-381可降低肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，其机制可能与ID-1表达下调有关。miR-381参与了肾癌细胞的增殖调控，可能成为肾癌新的治疗靶点。然而，本研究是在体外细胞系中进行的实验研究，至于在动物实验中结果如何以及miR-381在体内组织中的表达与肿瘤预后的关系，都需要进一步研究。

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