湿润烧伤膏对糖尿病大鼠创面组织细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1 mRNA表达水平及超微结构的影响研究

王丽，李杰辉，张春霞，狄钾骐，刘明，刘雪琴

糖尿病性溃疡是糖尿病患者严重的并发症之一。研究表明，15%～20%糖尿病患者在糖尿病发展进程中会出现足部溃疡甚至坏疽，导致截肢率大幅提高，糖尿病性溃疡是糖尿病患者致残、致死的重要原因之一［1-3］。糖尿病患者皮肤存在“隐形损害”［4］，晚期糖基化终末产物（AGEs）与AGEs受体（RAGE）在内皮细胞表面结合后，会启动一系列受体信号转导途径参与糖尿病创面愈合，其中作为炎性损伤相关的血管内皮因子，细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）发挥着关键作用［5］。湿润烧伤膏（MEBO）目前广泛应用于皮肤溃疡创面的修复［6-7］，取得较好的临床疗效，本课题组前期发现其促愈机制可能与调控创面组织AGEs-RAGE信号转导通路有关［8］，本研究在此基础上观察MEBO对糖尿病性溃疡创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达及超微结构的影响，进一步探讨MEBO促进糖尿病性溃疡创面愈合的药物作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠145只，SPF级，12周龄，体质量（220±30）g，由广西医科大学实验动物中心〔许可证号SCXK（桂）2009-0002〕提供。大鼠饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度（60±10）%，单笼饲养2周适应环境后用于实验。本研究经广西壮族自治区中医药研究院实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验药品与试剂 MEBO（汕头市美宝制药有限公司，生产批号：400803A），链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，生产批号：SLBH0076V），低精蛋白锌胰岛素注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，生产批号：13102312），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），重组牛碱性成纤维细胞生长因子（贝复济，珠海亿胜生物制药有限公司，批号：20140403），1st Strand cDNA合成试剂盒（日本TaKaRa Bio株式会社），Power SYBR® Green PCR Master Mix（ 美 国 ABI公司）。引物设计及合成由中山大学达安基因股份有限公司完成。引物序列如下：ICAM-1上游引物：5'-CTGCAGAGCACAAACAGCAGA-3'， 下 游 引 物：5'-AAGGCCGCAGAGCAAAAGAAGC-3'；VCAM-1 上游引物：5'-TAAGTTACACAGCAGTCAAATGGA-3'，下游引物：5'-CACATACATAAATGCCGGAATCTT-3'；β-actin上游引物：5'-TCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物：5'-AAAGCCATGCCAAATGTCTC-3'。

1.3 实验仪器 台式高通量DNA合成仪（型号：3900，美国ABI公司），全自动荧光PCR仪（型号：7500，美国ABI公司），PCR仪（型号：9700，美国ABI公司），高速冷冻离心机（型号：HC-3018R，安徽中科中佳科学仪器有限公司），透射电子显微镜（型号：H-7650，日本日立公司），美迪信血糖仪及配套血糖试纸（天津亿朋医疗器械股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 2015年6月，采用随机数字表法，将145只健康雄性SD大鼠分为空白组（35只）和糖尿病模型组（110只），糖尿病模型组制备糖尿病大鼠模型，SD大鼠给予65 mg/kg STZ腹腔注射［9］，在造模前后采用剪尾法使用血糖仪测定随机血糖，使用电子秤每周称量大鼠体质量。成模标准：造模前随机血糖＜8.9 mmol/L，造模后随机血糖≥16.7 mmol/L，大鼠体质量明显下降，并抽取胰腺组织病理显示胰岛细胞被破坏视为造模成功。参照赵京禹等［10］方法制备糖尿病性溃疡创面模型：采用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射将大鼠麻醉，呈腹卧位固定，背部脱毛，用直径为18 mm的圆形图章于大鼠脊柱正中距离肩胛骨下缘水平位置约2 cm处印出圆形标记，1%碘伏消毒后，根据标记剪去全层皮肤，深至筋膜，制成糖尿病性溃疡创面。

1.4.2 干预方法 糖尿病造模诱导8周后，共造模成功94只，将体质量过小（＜180 g）成模大鼠或体质量过大（＞350 g）空白组大鼠剔除后，剩余90只成模大鼠和30只空白组大鼠，制备糖尿病性溃疡创面模型，采用随机数字表法将成模大鼠分为模型亚组、贝复济亚组、MEBO亚组，每组30只。模型制备成功后，根据课题组前期研究方法［8］进行干预治疗，空白组及模型亚组给予0.9%氯化钠溶液纱条、MEBO亚组给予MEBO纱条、贝复济亚组给予贝复济溶液纱条局部换药处理，1次/d，共12 d。单笼饲养每组大鼠并自由饮食。

1.4.3 标本采集 各组分别于创面干预治疗后第3、6、12天，每次随机选取10只大鼠，麻醉后采集相同位点创面组织，一部分放置液氮中保存以备荧光聚合酶链式反应（PCR）检测，一部分以2.5%戊二醛和1.0%锇酸固定进行电镜超微结构观察。

1.4.4 指标检测

1.4.4.1 创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达测定

取出液氮冻存的创面组织，根据试剂盒说明提取总RNA，将组织加入1 ml Trizol，充分振荡，加入三氯甲烷 0.2 ml，摇动 15s，混匀，15～30 ℃孵育 2～3 min，4℃高速离心机，12 000 r/min离心15 min（离心半径为6cm）后取上清液，加入等体积异丙醇，15～30 ℃孵育10 min，4 ℃高速离心机，12 000 r/min离心10 min（离心半径为6 cm）后弃上清液，加入75%乙醇〔含焦碳酸二乙酯（DEPC）水〕洗涤沉淀1次，4℃高速离心机，7 500 r/min离心5 min（离心半径为6 cm）后弃乙醇，空气干燥5～10 min，加DEPC水溶解RNA，-80 ℃保存备用。在反转录体系中扩增合成cDNA，将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：2×Power SYBR® Green PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物（10 pmol/μl）0.5 μl， 下 游 引 物（10 pmol/μl）0.5 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR 扩增条件：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火延伸45 s，共40个循环。以β-actin作为内参基因，实验结果分析Ct值，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

1.4.4.2 超微病理检测 创面组织采用2.5%戊二醛和1.0%锇酸进行固定，经过脱水以及环氧树脂浸透和包埋，制作成60 nm的超薄组织切片，再以醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色，干燥后电镜观察超微病理结构。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组创面组织ICAM-1 mRNA表达水平比较 4组干预治疗后第3、6、12天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中，模型亚组第3天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平低于空白组，第6、12天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平均高于空白组（P＜0.05）；贝复济亚组第12天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平低于模型亚组（P＜0.05）；MEBO亚组第3天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平高于模型亚组，第6、12天创面组织ICAM-1 mRNA表达水平均低于模型亚组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 4组大鼠不同时间创面组织ICAM-1 mRNA表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of expression level of ICAM-1 mRNA among four groups of rats at different time points

表1 4组大鼠不同时间创面组织ICAM-1 mRNA表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of expression level of ICAM-1 mRNA among four groups of rats at different time points

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型亚组比较，bP＜0.05；MEBO=湿润烧伤膏

组别 只数 第3天 第6天 第12天空白组 10 1.00±0.31 1.00±0.31 1.00±0.32模型亚组 10 0.31±0.09a 4.39±0.84a 4.96±1.36a贝复济亚组 10 0.40±0.14 3.03±0.73 3.42±1.16b MEBO 亚组 10 0.62±0.14b 2.82±1.10b 2.66±0.72b F值 25.939 30.386 28.371 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 4组创面组织VCAM-1 mRNA表达水平比较 4组干预治疗后第3、6、12天创面组织VCAM-1 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中，模型亚组第3天创面组织VCAM-1 mRNA表达水平低于空白组，第6、12天创面组织VCAM-1 mRNA表达水平均高于空白组（P＜0.05）；贝复济亚组、MEBO亚组第3天创面组织VCAM-1 mRNA表达水平均高于模型亚组，第6、12天创面组织VCAM-1 mRNA表达水平均低于模型亚组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 4组大鼠不同时间创面组织VCAM-1 mRNA表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of expression level of VCAM-1 mRNA amang four groups of rats at different time points

表2 4组大鼠不同时间创面组织VCAM-1 mRNA表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of expression level of VCAM-1 mRNA amang four groups of rats at different time points

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型亚组比较，bP＜0.05

组别 只数 第3天 第6天 第12天空白组 10 1.00±0.43 1.00±0.48 1.00±0.31模型亚组 10 0.34±0.14a 3.83±1.07a 4.14±1.20a贝复济亚组 10 0.56±0.16b 1.30±0.45b 1.57±0.44b MEBO 亚组 10 0.62±0.20b 1.08±0.32b 1.75±0.77b F值 11.215 43.933 33.091 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 创面组织超微结构病理观察 透射电镜观察显示，干预治疗后第3天，空白组成纤维细胞内质网扩张，细胞器少，散在部分胶原纤维；模型亚组成纤维细胞内质网扩张，细胞中内容物少，线粒体空化，胶原生成较少；贝复济亚组成纤维细胞内质网肿胀，线粒体空泡，散在部分胶原纤维；MEBO亚组成纤维细胞内质网扩张不明显，线粒体基本正常，部分空泡（见图1）。第6天，空白组内皮细胞细胞核肿胀，细胞浆内粗面内质网扩张；模型亚组内皮细胞细胞核肿胀，线粒体有空泡，内质网肿胀扩张，血管腔变窄；贝复济亚组内皮细胞细胞核肿胀，线粒体空泡，血管腔变窄；MEBO亚组内皮细胞细胞核稍有肿胀，线粒体部分空泡，粗面内质网未见明显扩张（见图2）。第12天，空白组成纤维细胞内容物多，内质网数量丰富，胶原纤维生成较多；模型亚组成纤维细胞内质网扩张，线粒体空泡，核糖体少，胶原纤维生成少；贝复济亚组成纤维细胞内质网扩张不明显，数量丰富，胶原纤维生成较多；MEBO亚组成纤维细胞内容物较丰富，内质网未扩张，胶原纤维生成较多（见图3）。

图1 4组干预治疗后第3天创面组织超微结构（×30 000，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色）Figure 1 Ultrastructureof the wound tissue at the 3rd day after intervention

图2 4组干预治疗后第6天创面组织超微结构（×30 000，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色）Figure 2 Ultrastructureof the wound tissue at the 6th day after intervention

3 讨论

细胞黏附分子（CAM）是一类调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互结合、起黏附作用的膜表面糖蛋白［11］。ICAM-1、VCAM-1是血管内皮因子，均属于CAM免疫球蛋白超家族成员，主要在成纤维细胞、血管内皮细胞及白细胞等细胞表面表达，与炎性损伤密切相关，炎性因子、氧化损伤及高糖损伤均可诱导ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达增加［12-13］。糖尿病患者体内存在大量AGEs，其与RAGE结合后，促使活性氧簇（ROS）产生，诱导氧化应激反应。异常的氧化应激水平导致糖尿病皮肤创伤修复起点异常，从而促进炎性反应，加重糖尿病皮肤病变。AGEs与RAGE相互作用还可激活核转录因子（NF-κB），进而激活一系列促炎性反应基因，诱导ICAM-1、VCAM-1转录与表达上调，增加血管通透性，触发瀑布式炎性反应，导致糖尿病创伤创面持续炎性损伤，难以愈合。本研究结果显示，在创面损伤第3天时，糖尿病性溃疡大鼠模型创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平尚低，创面组织超微结构亦提示成纤维细胞内质网扩张，线粒体空化；创面损伤第6、12天时，创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达持续升高，呈炎性过激状态，超微结构亦提示内皮细胞、成纤维细胞细胞核肿胀，线粒体空泡，内质网明显肿胀扩张。既往文献报道显示，糖尿病大鼠溃疡创面损伤第7天，创面组织ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达呈上升趋势，第14天创面组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达明显增加［14］。本研究检测糖尿病性溃疡发生后第3、6、12天创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达，第6、12天结果与文献［14］基本相符，第3天创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达下降，提示糖尿病性溃疡发生早期，创面炎性反应应激能力下降。

图3 4组干预治疗后第12天创面组织超微结构（×30 000，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色）Figure 3 Ultrastructure of the wound tissue at the 12th day after intervention

皮肤再生医疗技术是当代中医药外治烧伤、创伤、溃疡的重要方法之一，MEBO作为其核心药物，可以通过祛腐生肌来修复创面，促进愈合［15-16］。本课题组前期研究显示，MEBO干预后，糖尿病性溃疡大鼠模型创面组织中AGEs含量及RAGE mRNA表达水平显著降低，能够调控NF-κB，并改善创面组织炎性细胞浸润，促进创面修复愈合［8］。因此，本研究选择AGEs-RAGE信号通路下游因子ICAM-1、VCAM-1为检测指标，在前期基础上，通过制备糖尿病性溃疡大鼠模型，观察MEBO的干预治疗作用。结果显示，与模型亚组比较，MEBO亚组大鼠创面损伤第6、12天时，创面组织ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平显著降低，超微结构亦显示内皮细胞、成纤维细胞内容物丰富，内质网未见明显扩张，细胞核和线粒体结构亦趋于完整，提示MEBO能通过调控ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平，明显改善创面组织细胞的超微结构，加速细胞器恢复正常，促进糖尿病性溃疡创面愈合。

综上所述，MEBO能调控创面组织AGEs-RAGE信号通路下游因子ICAM-1、VCAM-1表达水平，显著改善糖尿病性溃疡大鼠创面组织细胞的超微结构，维持细胞内环境，促进细胞增殖分化，进一步证实MEBO治疗糖尿病性溃疡的药物作用靶点，可能与AGEs-RAGE信号通路有关，从而为糖尿病性溃疡创面的中医药干预治疗机制提供了实验依据。本研究仅对AGEs-RAGE信号通路下游因子ICAM-1、VCAM-1进行了实验观察，对信号通路中氧化应激、炎性因子等指标的影响，有待后续实验进一步研究明确。

本文意义：

本研究从细胞超微结构及分子基因水平研究湿润烧伤膏治疗糖尿病性溃疡创面的修复机制。通过建立糖尿病性溃疡大鼠模型，观察湿润烧伤膏在治疗过程中对创面组织细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）基因表达的影响，以及对组织细胞结构及功能的改变，明确了湿润烧伤膏治疗糖尿病性溃疡的部分药物作用机制，为湿润烧伤膏的临床应用提供实验依据和理论依据，为进一步深入探讨糖尿病性溃疡创面愈合的修复机制提供了可能的参考指标。

作者贡献：王丽、李杰辉进行文章的构思与设计，结果的分析与解释；王丽、李杰辉、张春霞、狄钾骐、刘明进行研究的实施与可行性分析；张春霞、狄钾骐进行数据收集；刘明、刘雪琴进行数据整理；张春霞进行统计学处理；王丽撰写论文，负责文章的质量控制及审校；李杰辉进行论文的修订，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

［1］付小兵.糖尿病足及其相关慢性难愈合创面的处理［M］．2版.北京：人民军医出版社，2013：3.FU X B.Treatment of diabetic foot and its related chronic refractory wounds［M］．2nd ed.Beijing：People's Military Medical Publishing House，2013：3.

［2］BOULTON A J.The diabetic foot：grand overview，epidemiology and pathogenesis［J］．Diabetes Metab Res Rev，2008，24（Suppl 1）：S3-6.DOI：10.1002/dmrr.833.

［3］BOULTON A J.The diabetic foot：a global view［J］．Diabetes Metab Res Rev，2000，16（Suppl 1）：S2-5.

［4］陆树良，谢挺，牛轶雯，等．糖尿病合并创面难愈的机制研究［J］．药 品 评 价，2011，8（7）：17-21.DOI：10.3969/j.issn.1672-2809.2011.07.005.LU S L，XIE T，NIU Y W，et al．Mechanism research of diabetic wound hard to be cured［J］．Drug Evaluation，2011，8（7）：17-21.DOI：10.3969/j.issn.1672-2809.2011.07.005.

［5］王丽，李杰辉.AGEs-RAGE信号通路与糖尿病难愈合创面［J］．中国烧伤创疡杂志，2015，27（6）：406-409.DOI：10.3969/j.issn.1001-0726.2015.06.004.WANG L，LI J H.AGEs-RAGE signaling pathway in diabetic refractory wounds［J］．Chinese Journal of Burns Wounds and Surface Ulcers，2015，27（6）：406-409.DOI：10.3969/j.issn.1001-0726.2015.06.004.

［6］TANG Q L，HAN S S，FENG J，et al．Moist exposed burn ointment promotes cutaneous excisional wound healing in rats involving VEGF and bFGF［J］．Mol Med Rep，2014，9（4）：1277-1282.DOI：10.3892/mmr.2014.1921.

［7］唐乾利，李杰辉，贺全勇，等．皮肤再生医疗技术在创面修复中的基础与临床应用研究［J］．右江民族医学院学报，2015，37（1）：1-4.DOI：10.3969/j.issn.1001-5817.2015.01.001.TANG Q L，LI J H，HE Q Y，et al．Basic and clinical research of skin regenerative medical technique（MEBT/MEBO）in wound repair［J］．Journal of Youjiang Medical University for Nationalities，2015，37（1）：1-4.DOI：10.3969/j.issn.1001-5817.2015.01.001.

［8］李杰辉，王丽，张春霞，等．湿润烧伤膏对糖尿病性溃疡大鼠创面组织晚期糖基化终末产物及其受体表达的影响研究［J］．中国全科医学，2016，19（26）：3153-3159.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.006.LI J H，WANG L，ZHANG C X，et al．Effect of MEBO on advanced glycosylation end products and their receptors in wound tissue of rats with diabetic skin ulcer［J］．Chinese General Practice，2016，19（26）：3153-3159.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.006.

［9］陆树良，青春，谢挺，等．糖尿病皮肤“隐性损害”的机制研究［J］．中 华 创 伤 杂 志，2004，20（8）：468-473.DOI：10.3760/j：issn：1001-8050.2004.08.005.LU S L，QING C，XIE T，et al．Research on olfactory mechanism of the cutaneous“underlying disorder”in diabetic rats［J］．Chinese Journal of Trauma，2004，20（8）：468-473.DOI：10.3760/j：issn：1001-8050.2004.08.005.

［10］赵京禹，付小兵，雷永红，等．大鼠小面积全层皮肤缺损创面模型的制备［J］．感染、炎症、修复，2008，9（1）：64.DOI：10.3969/j.issn.1672-8521.2008.01.018.ZHAO J Y，FU X B，LEI Y H，et al．The preparation of the defect wound model in the small area of the rat skin［J］．Infection，Inflammation，Repair，2008，9（1）：64.DOI：10.3969/j.issn.1672-8521.2008.01.018.

［11］唐可京，谢灿茂，李幼姬.细胞间黏附分子-1和血管细胞间黏附分子-1的结构与功能［J］．细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：193-195.DOI：10.3321/j.issn：1007-8738.2002.02.037.TANG K J，XIE C M，LI Y J.The structure and function of ICAM-1 and VCAM-1［J］．Journal of Cellularand Olecular Immunology，2002，18（2）：193-195.DOI：10.3321/j.issn：1007-8738.2002.02.037.

［12］游佳华.黏附分子与内皮细胞损伤的研究进展［J］．临床荟 萃，2006，21（9）：677-678.DOI：10.3969/j.issn.1004-583X.2006.09.042.YOU J H.The research progress on adhesion molecules and endothelial cell damage［J］．Clinical Focus，2006，21（9）：677-678.DOI：10.3969/j.issn.1004-583X.2006.09.042.

［13］苏胜.血管内皮功能障碍与2型糖尿病研究进展［J］．实用心脑肺血管病杂志，2016，24（4）：321-321.SU S.Progress of Vascular endothelial dysfunction and the type 2diabetes［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24（4）：321-321.

［14］李巧芬，常柏，李云平，等．生肌象皮膏对糖尿病大鼠溃疡愈合中VCAM-1与ICAM-1的影响［J］．天津中医药，2013，30（12）：735-738.DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2013.12.11.LI Q F，CHANG B，LI Y P，et al．Effect of Shengji Xiangpi plaster on expression of VCAM-1 and ICAM-1 in rats with diabetic ulcer in wound healing［J］．Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，30（12）：735-738.DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2013.12.11.

［15］唐乾利，黄欣，王宇，等．湿润暴露疗法/湿润烧伤膏治疗慢性难愈合创面的超微病理及丝裂原活化蛋白激酶激酶和c-myc mRNA表达的机制研究［J］．中国全科医学，2015，18（3）：294-299.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.03.17.TANG Q L，HUANG X，WANG Y，et al．Ultrastructural pathology and the mechanism ot expression ot MAPKK mRNA& c-myc mRNA ot chronic retractory wound treated by MEBT/MEBO［J］．Chinese General Practice，2015，18（3）：294-299.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.03.17.

［16］吴标良，唐乾利，覃晓洁，等．烧伤皮肤再生医疗对糖尿病足ERK1/2和p38信号通路分子的调控［J］．中国全科医学，2015，18（29）：3592-3595.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.29.021.WU B L，TANG Q L，QIN X J，et al．Regulation of burn skin regeneration on ERK1/2 and p38 signaling pathway molecules in diabetic foot［J］．Chinese General Practice，2015，18（29）：3592-3595.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.29.021.