禽呼肠病毒S1基因编码蛋白合成机制研究进展

谭 伟，黄 莉，谢芝勋

(广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001)

禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)是没有囊膜、分节段的双链RNA病毒,病毒粒子以对称的二十面体形式存在，直径约为70 nm～80 nm,成熟的病毒颗粒内含有呈线性排列且由10个双链RNA基因节段组成的病毒基因组[1]。病毒的10个RNA基因片段可分为3类，即L(Large)类、M(Middle)类和S(Small)类。L类RNA的分子质量较大，包括病毒基因片段L1、L2和L3。M类RNA的分子质量中等，含有基因片段M1、M2和M3。S类RNA基因的分子质量较小，由S1、S2、S3和S4共4种RNA分子所组成[1]。ARV的10个RNA基因片段可以编码病毒的8种结构蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC)及4种非结构蛋白(μNS、σNS、p10和p17)[2]。其中，S1基因片段的结构比较特殊，含有3个相互重叠的基因编码区，可利用不同的翻译机制分别合成3种蛋白，即非结构蛋白p10、p17和结构蛋白σC。本文着重介绍禽呼肠病毒S1基因编码蛋白的合成机制。

1 真核细胞内蛋白质的合成机制

与其他病毒一样，ARV也必须借助于易感细胞内的蛋白翻译体系合成病毒自身的蛋白[2]。真核细胞合成蛋白质的机制主要包括核糖体扫描翻译机制、漏过扫描机制、重新启动翻译机制及核糖体分路翻译机制及内部起始翻译机制等[3-4]，不依赖于mRNA。为了便于理解ARV的S1基因片段合成病毒蛋白的机制，下面扼要介绍真核细胞内蛋白合成的几种常见形式。

1.1 核糖体扫描翻译机制

真核细胞中的mRNA多数以单顺反子存在，主要通过依赖于mRNA 5′末端帽状结构的核糖体扫描翻译机制来合成蛋白。一般认为，核糖体40 S小亚基首先与多个蛋白翻译起始因子相互作用，然后和mRNA 的5′末端帽状结构结合，并沿着mRNA链以线性方式，从5′末端向3′末端移动，当遇到第一个蛋白翻译起始密码子AUG时，核糖体40 S小亚基与60 S大亚基结合形成80 S复合物，从而启动蛋白质的翻译[5]。

1.2 漏过扫描机制

当离mRNA 5′末端帽状结构最近的AUG所处的碱基序列环境欠佳时，也就是说与最佳的Kozak序列(A-3CCAUGG+4)有较大差别时，部分40 S小亚基会滑过这个AUG，继续向mRNA的3′末端移动，直到遇上合适的蛋白翻译起始密码子时才启动翻译[3,6]。

1.3 重新启动翻译机制

当mRNA含有的第1个蛋白翻译开放阅读框(open reading frame,ORF)ORF1翻译结束后，核糖体可以继续沿着mRNA 向3′末端移动，若遇上ORF2中适宜的AUG密码子，则可启动ORF2的翻译。重新启动翻译有两个必要条件：①ORF1的长度应小于30个密码子，以避免丢失过多的蛋白翻译起始因子；②ORF1与ORF2之间的距离应大于70个核苷酸，以使移动的40 S小亚基有足够的时间重新结合蛋白翻译所需的各种必要因子[7]。

1.4 内部启动翻译机制

此翻译机制不依赖于mRNA 5′末端的帽状结构，但取决于mRNA是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)。当IRES存在时，40 S小亚基可直接与位于AUG密码子上游的IRES结合，当40 S小亚基向下游移动、遇到合适的AUG时，即可启动蛋白翻译[8]。这种翻译模式多见多种病毒，例如，微小RNA病毒、古典型猪瘟病毒、牛病毒腹泻病毒及丙型肝炎病毒等[2,9-10]。

1.5 核糖体分路翻译机制

核糖体分路翻译机制最早见于花椰菜花叶病毒[11]。这种翻译模式不仅依赖于mRNA 5′末端帽状结构，同时可通过非线性移动的方式跨越低能量的发卡结构或多个短小开放阅读框架(short ORF,sORF)，直接抵达下游所需翻译的ORF[3]。简单地说，核糖体首先与mRNA 5′区域中的供位结合，经非线性迁移到达mRNA 3′区域内的受位；然后沿着mRNA 向3′端继续移动，当遇到适宜的AUG时，即可启动蛋白翻译程序。此外，靠近mRNA 5′末端的sORF的长度介于2个～10个密码子时，通过核糖体分路翻译机制合成蛋白的效率最佳[12]。

2 禽呼肠病毒的p10、p17 及σC蛋白的翻译机制

在ARV的10个RNA基因节段中，其中有9个基因片段为单顺反子，可以直接利用核糖体扫描翻译机制合成相对应的病毒蛋白产物。只有S1基因片段较为特殊，为多顺反子结构，含有3个相互重叠的ORFs，分别编码结构蛋白σC及非结构蛋白p10、p17。ARV S1基因中的3个ORF在先后排列次序上具有高度保守性 ，即ORF1(p10基因)接近S1基因的5′末端，ORF2(p17基因)位于S1基因中部，而ORF3(σC基因)则最靠近S1基因的3′末端[13]。

2.1 ARV S1基因的ORF1合成p10蛋白的机制

p10是ARV的非结构蛋白，具有融合细胞的功能[14]。p10蛋白含有98个氨基酸，分子质量10 ku，由S1基因中的ORF1编码[15]。ORF1的长度为297个核苷酸，其翻译起始密码子AUG位于第25-27位核苷酸，而蛋白翻译终止密码子UGA则位于第319-321位核苷酸。

研究表明，Kozak M[16]序列(CCA-3CCAUGG+4)含有蛋白翻译起始密码子AUG所需的最佳碱基序列环境。人们将此序列里AUG中腺苷A的位置定为+1，并证明-3位的腺苷A或鸟苷G及+4位的鸟苷G可直接影响到蛋白翻译起始的效率。p10基因的蛋白翻译密码子AUG周围的碱基序列为U-3CGAUGC+4。由于此序列的-3位为尿嘧啶核苷U，不是碱基A或G；+4位的碱基为C而不是G，并非最佳的Kozak序列，所以认为p10基因的AUG起始密码子属于蛋白翻译的弱起动子。若将此弱起动子的碱基序列优化接近于Kozak序列，即变成A-3CCAUGG+4后，则p10蛋白的表达量可以增加约15倍[17]。ORF1中第25-27位的AUG是S1 mRNA中的第1个起始密码子，去除S1 mRNA 5′末端帽状结构会明显抑制p10蛋白的表达[18]，因此普遍认为ORF1是利用核糖体扫描翻译机制来合成p10蛋白的。虽然p10蛋白的翻译起始密码子AUG最靠近S1 mRNA 5′末端，但由于它是蛋白翻译的弱起动子，因此在ARV感染细胞中，p10蛋白的表达量较低[18]。

2.2 ARV S1基因的ORF2合成p17蛋白的机制

p17是ARV的非结构蛋白，参与调节细胞周期、激活p53和PTEN蛋白，促进ARV在细胞内的繁殖[19-20]。p17蛋白含有146个氨基酸，由S1基因中的ORF2编码[15]。ORF2的长度为441个核苷酸，其翻译起始密码子AUG位于第293-295位核苷酸，而蛋白翻译终止密码子UGA则位于第731-733位核苷酸[13]。此AUG周围的碱基序列为A-3CAAUGC+4。虽然此序列中的-3位是腺苷A，但-4位却不是鸟苷G，而是胞嘧啶核苷C。早期的研究认为，+4位的鸟苷G是蛋白翻译强起动子的基本特征。后来研究发现+4位的鸟苷G并不像最初认为的那么关键，只有当-3位不是腺苷A时，位于+4位的鸟苷G才对蛋白翻译的效率有明显影响。目前认为-3位的嘌呤碱基A或G，特别是腺苷A是蛋白翻译强起动子的重要特征[21]。所以，p17蛋白的翻译起始密码子AUG仍被看成是蛋白翻译的强起动子[17]。此外，将p10基因蛋白翻译弱起动子周围的碱基优化为强起动子序列时，p10蛋白的表达增加，而p17蛋白的表达却明显减少[17]，提示S1 mRNA中的ORF2是利用漏过扫描机制来合成p17蛋白的。

2.3 ARV S1基因的ORF3合成σC蛋白的机制

σC是禽呼肠病毒的结构蛋白，氨基酸变异程度最高[22-23]。σC蛋白是ARV编码的蛋白中唯一能吸附易感细胞的病毒蛋白，并能诱导被感染的细胞发生死亡[24]，同时σC蛋白是ARV的主要中和抗原，能刺激机体产生抑制病毒繁殖的中和抗体[24]。σC蛋白含有326个氨基酸，分子质量约为35 ku，由S1基因中的ORF3编码[15]。ORF3长度为978个核苷酸，在S1基因的3个ORF中长度最长[25]。σC蛋白翻译起始密码子AUG位于第630-632位核苷酸，而蛋白翻译终止密码子UAA位于第1 608-1 610位核苷酸[13]。σC蛋白的翻译起始密码子AUG周围的碱基序列为G-3GGAUGG+4，第-3位和第+4位的碱基均为鸟苷G，属于最佳的Kozak序列环境，所以此AUG被视为蛋白合成的强起动子[13,16]。此外，这个AUG起动子与S1基因的5′末端甲基化帽状结构之间的距离长达600多个碱基。值得注意的是，σC蛋白的翻译起始密码子AUG(630-632 nt)的上游有4个AUG，前2个AUG属于蛋白翻译的弱起动子(25-2 nt7,34-36 nt)，而后2个 AUG则属于强起动子(293-295 nt,298-300 nt)[16]；其中1个弱起动子(25-27 nt)负责编码p10蛋白，而另外2个强起动子负责分别编码p17蛋白和σC蛋白[16]。那么，σC蛋白到底是通过什么翻译机制来合成的呢？理论上有以下3种假设。

2.3.1 第1种假设：重新启动翻译机制 考虑到编码p10蛋白的ORF1 和编码σC蛋白的ORF3之间不存在AUG起始密码子[13]，一部分40S核糖体在完成p10蛋白的翻译后，可能会继续沿着S1 基因向3′末端移动，当遇到σC蛋白的翻译起始密码子AUG时，可重新启动蛋白翻译。所以，重新启动翻译是σC蛋白合成的可能机制之一。重新启动翻译机制通常要求靠近5′末端、被首先翻译的上游ORF(upstream ORF,uORF)的长度少于30个密码子[12]，而编码p10蛋白的ORF1含有98个密码子，至少3倍于30个密码子的长度。另外，将ORF1的蛋白翻译弱起动子AUG周围的碱基序列优化之后，不能显著提高σC蛋白的表达量。因此，通过重新启动翻译机制合成σC蛋白的可能性被排除[17-18]。

2.3.2 第2种假设：内部启动翻译模式 此模式认为若一个mRNA含有IRES，则核糖体40S小亚基不需要与mRNA 5′末端的帽状结构相互作用，而能直接与mRNA内部的IRES结合。当40 S小亚基继续沿着mRNA 的3′末端向前移动、遇上合适的蛋白翻译起动子AUG时，就会与60 S核糖体大亚基结合，开始合成蛋白。由于S1基因mRNA 5′末端的非翻译区很短，仅有24个核苷酸，形成RNA二级结构的可能性很小；同时在ORF1与ORF3之间的区域未发现茎-环样的RNA二级结构，因此，通过内部启动翻译模式合成σC蛋白的假设也难以成立[18]。

2.3.3 第3种假设：促进漏过扫描翻译模式和非典型的核糖体分路翻译机制 一些研究人员认为，σC蛋白的合成与IRES结构无关，但依赖于蛋白翻译起始因子eIF4G的功能以及S1 mRNA 5′末端的帽状结构，并能以非线性移动的方式到达σC蛋白翻译起始密码子的上游区域[18]，通过促进漏过扫描机制合成σC蛋白。另一些试验数据显示，σC蛋白是以全长的S1 mRNA为模板而合成的，并且σC蛋白翻译的效率基本上不受uORF的影响。

Racine T等[18]早期提出的假设认为，核糖体与S1 mRNA的5′末端帽状结构结合，翻译p10蛋白后，可以通过非线性的移动方式到达σC蛋白的翻译起始密码子附近的区域，启动σC蛋白的合成。随后的研究显示，核糖体能通过两种不同的、依赖于S1 mRNA 5′末端帽状结构的模式接近σC蛋白的翻译起始密码子[19]。模式一为促进漏过扫描翻译模式。在此模式中，核糖体能有效通过多个uORF中处于较佳碱基序列环境的AUGs，靠近σC蛋白的翻译起始密码子。模式二为非典型的核糖体分路翻译机制。此模型不依赖于漏过扫描翻译机制，相对不受uORF的影响，但仍依赖于S1 mRNA 5′末端的帽状结构，并需要借助于ORF2中蛋白翻译增强子(translation enhancer element,TEE)的帮助，将40 S小亚基转送到σC蛋白翻译起始密码子上游的区域[19]。具体来说，与S1 mRNA 5′末端帽状结构相结合的40 S小亚基，可绕过1个或几个uORFs中的AUGs，被直接转移到p17蛋白的翻译起始密码子下游的区域。这种转移过程与ORF2中所含的蛋白翻译增强子TEE有关。TEE由27个核苷酸组成，位于S1 mRNA中的第366位和392位核苷酸之间。其中的6个核苷酸(CCCAUC)含有与18 S rRNA互补的碱基序列，能促进40S小亚基以非线性方式转移到σC蛋白翻译起始密码子上游区域。因此，目前一般认为，σC蛋白是通过促进漏过扫描翻译模式和非典型的核糖体分路翻译两种机制进行合成的[19]。

3 结语

禽呼肠病毒S1 mRNA自身结构中含有能发挥顺式作用的蛋白翻译增强子TEE，可以通过促进漏过扫描翻译和非典型的核糖体分路两种翻译机制，帮助核糖体接近σC蛋白的翻译起始密码子[19]，以便产生适量的σC蛋白。由于ARV的 σC蛋白直接参与病毒吸附易感细胞的早期阶段，因此保证σC蛋白的适量表达对ARV进入易感细胞和产生新的子代病毒尤为重要。深入研究涉及S1基因多顺反子合成病毒蛋白的影响因素，有助于进一步阐明禽呼肠病毒p10、p17和σC蛋白翻译的确切机制，帮助发现调控这3种病毒蛋白表达的相关因子，找出抑制ARV在细胞内复制繁殖的关键靶位，对研发抗ARV新药及ARV疫苗具有重要的理论意义和实际应用价值。

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