microRNA在乳腺肿瘤诊断中的研究进展

任晓丽，常宏建，赵冰冰，肖 敏，刘 云

(东北农业大学动物医学学院黑龙江省重点实验室/实验动物与比较医学重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

乳腺肿瘤是全世界范围内严重威胁女性生命和健康的最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐渐升高的趋势。据国际癌症研究机构(http://www.iarc.fr/)报道，在2012年，170万妇女被诊断患有乳腺癌，在过去5年中630万女性被诊断患有乳腺癌，2012年因乳腺瘤死亡522 000人[1]。犬乳腺肿瘤是一种发生于母犬的自发性肿瘤，其发病率约是女性的3倍，病理组织学诊断约50%为恶性肿瘤，其分子表型和生物学特征与人类乳腺肿瘤相似，适合作为研究人类乳腺肿瘤的模型[2]。乳腺肿瘤具有异质性，基于不同的基因表达谱，分为不同亚型，肿瘤转移扩散是造成患者死亡的主要原因。microRNA(miRNA)是正常和异常生物过程(包括癌症)中调控机体mRNA表达的关键调节剂，miRNA的失调发生在各种类型的癌症中，与肿瘤发生、耐药性和转移有关[3]。因此，基于调节miRNA表达水平和鉴定其靶标是乳腺癌早期诊断的有力依据。本文主要总结miRNA在乳腺肿瘤发展中的主要功能，并讨论调控miRNA表达和检测miRNAs水平的临床应用。

1 miRNA的生物合成和功能

miRNA是一类进化上高度保守的非编码单链小分子RNA，大小为18 nt～23 nt，转录后调节基因表达。大部分的miRNA主要通过RNA聚合酶Ⅱ作用被转录成茎环样结构的pri-miRNA，很少一部分由RNA聚合酶Ⅲ转录。细胞核内的初级pri-miRNA在Drosha酶(RNase Ⅲ酶)及其辅助因子DGCR8作用下被剪接，修饰成70 nt～100 nt的pre-miRNAs(pre-miRNAs也可以通过mirtron途径产生；通过核转运受体(Exportin-5：Ran依赖性核转运受体家族的成员)将Pre-miRNA转运到细胞质，在Dicer和TRBP或ADR1作用下，将Pre-miRNA进一步切割成大约22 nt的不完全互补配对的双链RNA；成熟miRNA的功能链被并入含有GW182和AGO蛋白的RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，作为该复合物的一部分，成熟的miRNA调节基因表达通过与靶mRNA的3′UTR或5′UTR中的部分互补序列结合，导致mRNA降解，翻译抑制或转录激活[4-5]；例如，Liu M等[6]发现嵌入基因的miR-483-5p直接与胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的5′UTR结合并诱导其在人肾母肿瘤中的转录，导致mRNA降解或翻译抑制。

2 miRNA常用的检测方法及验证方法

2.1 miRNA的检测方法

2.1.1 RT-qPCR RT-qPCR方法是目前临床上检测肿瘤样本miRNA表达量最常用的方法，分为茎环法、polyA加尾法。其主要差别在于RT-qPCR之前的cDNA制备过程，两步法是通过独特设计的茎环结构引物进行反转录将miRNA反转录成cDNA。而polyA加尾法是利用反转录过程将miRNA反转录成cDNA并加上独特设计的尾部序列。茎环法的优势是特异性高，miRNA 3′序列易出现多样化现象，影响检测准确性。而polyA加尾法则不受这一现象的影响，polyA加尾法的特异性如今已经可以和茎环法媲美，成本低[7]。

2.1.2 Northern blot Northern blot是被誉为检测miRNA的经典方法，其原理是通过尿素变性凝胶电泳的方法，根据大小进行片段分离，将与目的miRNA互补的标记的探针杂交到硝酸纤维素膜或尼龙膜上显影检测。检测结果可同时用于miRNA表达水平的定量检测和用于区分miRNA前体与成熟体的位置。地高辛和锁核苷酸是常用的探针标记，其优点是鉴定miRNA的分子量大小，并可以显示多个miRNA的分子量大小及浓度；缺点是操作繁琐，灵敏度低；同时miRNA不易结合于固相杂交膜上，耗费大量RNA样本，敏感性低；还会增加RNA酶容易降解的风险[7]。

2.1.3 高通量技术 基因芯片技术兴起于20世纪90年代，其优势是具有极高的检测通量，检测成本较低，但是基因芯片只能显示出2倍以内的表达差异，属于定性半定量检测技术。Small RNA测序是一种最新的高通量测序技术，采用胶分离技术，收集样品中18 nt～30 nt RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息，依托生物学信息分析技术，鉴定已知小miRNA并预测新的miRNA及其靶基因，增加了新miRNA发现率。技术优势包括：①通量高。一次测序得到500万条以上的序列；②分辨率高。可以检测小 RNA单个碱基的差异；③精准度高。从几个到数十万个拷贝精确计数；④不依赖已知信息。既能鉴定已知小RNA，又能发现新小RNA；⑤可重复性高。深度测序保证了抽样随机性，重复性非常好。但该技术价格昂贵，对miRNA样本处理要求较高，且随着读长增加，荧光信号逐渐减弱，碱基准确性会逐渐降低，使得深度测序读长受到一定限制[8]。

2.2 miRNA-靶标相互作用验证

目前，已经开发了许多验证miRNA-mRNA相互作用的实验技术。一般来说，使用miRNA模拟物或miRNA抑制剂寡核苷酸或构建载体转染，在蛋白质水平上通过蛋白质印迹和mRNA水平通过RT-qPCR(携带具有靶基因的特异性探针)方法获得靶基因的差异miRNA表达的影响，缺点是不能区分miRNA靶标直接和间接相互作用。

2.2.1 萤光素酶测定 荧光素酶测定通常用于研究与其他细胞事件相关的基因表达，例如受体活性或蛋白质-蛋白质相互作用的细胞内信号转导。萤火虫荧光素酶测定被广泛用于分析miRNA-mRNA直接的相互作用，原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游，构建成荧光素酶报告质粒，转染细胞，将模拟物miRNA或抑制剂miRNA转入细胞中，检测荧光素酶活性的高低判断miRNA和靶基因的3′UTR的之间的作用程度，通常将Renilla(REN)荧光素酶用作发光标准化的参考基因。该方法优势在于报告物活性在翻译后立即产生，测定非常快速和灵敏，并且在宿主细胞及检测试剂中没有荧光背景。缺点是费时，价格昂贵，仅对于选择用于克隆的3′UTR敏感，并且难以用于转染[9]。

2.2.2 RISC免疫沉淀 RISC的免疫沉淀反应(如AGO和TNRC6)能直接识别和分离miRNA靶标复合物的生物化学方法。该方法能获得低丰度和短暂的miRNA-mRNA对。miRNA调控的靶mRNA与RISC一起进行免疫沉淀反应，并通过RT-qPCR、微阵列或深度测序等方法进行分析。整个复合体的连续断开依赖于miRNA靶标复合物和RISC之间的强相互作用以及所用抗体能沉淀AGO2(核心RISC蛋白通常用于复合免疫沉淀反应)。一些公司已经开发出RISC蛋白亚基的显性负突变体，以将miRNA靶标复合体捕获到RISC中，从而限制进一步的处理，这种方法可以恢复瞬时和低丰度mRNA靶标，否则会丢失，然后使用FLAG表位捕获整个复合物，使用RT-qPCR或新一代测序技术来鉴定miRNA和靶mRNA之间的相互作用[10]。

3 miRNA与乳腺肿瘤

miRNA表达的时序性和组织特异性提示可能靶向人类中的任何mRNA。miRNA在细胞分化、生物发育及疾病发展过程(癌症)中发挥巨大的作用。关于乳腺癌诊断和治疗取得了进展，但仍不乐观。Bertoli G等[3]研究表明，miRNA在乳腺癌中发挥肿瘤抑癌基因或癌基因或同时具有两者的双重作用，超过50%的人类miRNA基因位于肿瘤相关基因组缺失和扩增区域染色体脆性位点，提示miRNA不仅有助于乳腺肿瘤早期诊断、预后评估和疗效预测，而且还起到新的治疗靶点和替代疗法的作用。下面讨论几种常见的miRNA 在乳腺肿瘤中作为癌基因或抑癌基因的功能。

3.1 miRNA-200家族

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429组成。基于染色体位置分为两个簇，其中簇1由miR-200b、miR-200a和miR-429组成，位于人类染色体1上，由miR-200c和miR-141组成的簇2，位于人类染色体12上。两个簇之间的基因序列仅由单个核苷酸区别，这表明miR-200的成员可能潜在地靶向相似的生理效应基因的共同亚群，由于两组间目标基因重叠程度相对较高，miR-200家族的所有成员适合作为靶向共同基因亚基的良好候选者。Noman M Z等[11]研究显示miR-200家族参与癌症干细胞(CSCs)和正常干细胞的自我更新的调控。miR-200c在胚胎癌细胞中的异位过度表达导致体内神经分化和抑制乳腺CSCs的致瘤性。Lutful K F等[12]通过犬CMT-12、CMT-27、CMT-28对miRNA RT-qPCR分析发现，miR-200a/b在3株细胞系中高度表达；而miR-200c不同的犬乳腺癌细胞系表达不同，CMT-12和CMT-27细胞系中高度上调，CMT-28细胞系表达下调。Damiano V 等[13]发现miR-200b / c通过抑制ZEB2表达促进间充质细胞向上皮细胞转化(MET)，促进乳腺癌细胞系中的宏观转移。miR-200家族暴露于转化生长因子-β(TGF-β)后下调，TGF-β可以作为诱导EMT表型的细胞因子，miR-200家族的重新表达显著抑制TGF-β诱导的EMT，而抑制miR-200家族的导致EMT表型的诱导，此外，在诱导EMT后，ZEB1和ZEB2的水平升高，这表明miR-200家族是间充质标记ZEB1和ZEB2的负调节因子。因此，这些研究表明miR-200家族在乳腺癌转移和侵袭性的调节中起关键作用。

3.2 let-7家族

let-7家族是哺乳动物第1个被确定的miRNAs，发现于秀丽隐杆线虫，在整个动物类群中保守，为公认的抑癌基因。let-7族由12个成员组成，包括let-7-a1、let-7-a2、let-7-a3、let-7-b、let-7-c、let-7-d、let-7-e、let-7-f1、let-7-f2、let-7-g、let-7-i和miR-98。Yu F等研究表明，let-7通常在分化程度较低的细胞中缺失，表现出间质表型并代表晚期癌，相反，let-7在分化程度高的细胞中高表达，表现出上皮表型并代表较早期癌。进一步研究发现使用let-7在BT-ICs中降低其增殖能力，形成乳腺球体和肿瘤形成和转移。相反，体外敲除let-7增强非BT-IC的自我更新；过表达let-7下调致癌靶标如H-RAS和HMGA2。在富含BT-IC的细胞系中沉默H-RAS减少自我更新，但不影响分化，同时敲除HMGA2增强分化，但没有影响自我更新，结果表明，let-7调节多种BT-IC干细胞样特性，因此通过靶向let-7在乳腺癌患者中的癌症治疗可能是有益的，可以作为新的治疗方案[14]。Dangi-Garimella S等[15]研究发现，RKIP蛋白(Raf激酶抑制蛋白)和let-7与乳腺癌转移相关，RKIP是抑制人类乳腺癌中的MAPK，G蛋白偶联受体激酶-2和NF-κB信号级联的抑癌基因，RKIP通过信号级联抑制侵袭和转移，其涉及MAPK、MYC、LIN28、et-7和下游let-7靶标，如HMGA2，与癌细胞转移相关。雌二醇(E2)可能会增强let-7家族的8个成员的水平增加。E2也作为雌激素受体α(ER-α)和雌激素受体β(ER-β)的配体，ER-α和let-7家族的各种成员之间的表达存在逆关联。与良性肿瘤相比，let-7家族miRNA在人乳腺癌细胞的原位导管癌和侵袭性导管癌的阶段中下调，let-7家族成员在ER阳性细胞中过表达导致ER-α活性下调，细胞增殖减少，诱导细胞凋亡。关于let-7的研究结果表明它可以用作未来的癌症治疗剂。目前普遍公认的是let-7水平在正常细胞中高表达，而在侵袭性癌细胞系中表达量降低。然而，let-7异常调控机制及其在肿瘤发生中的作用尚未完全了解，进一步研究癌症中let-7活性背后的分子机制将改善治疗应用的治疗计划。

3.3 miR-145

miR-145作为一种抑癌基因，在特异性阶段中通过沉默不同的靶基因发挥肿瘤抑制功能。Osaki T等[16]对SNP(犬乳腺癌细胞系)和犬的正常乳腺组织miRNA 分析结果显示，与正常相比，miR-145在SNP细胞中高表达，表达差异933.499倍，而Boggs R M等[17]研究显示犬乳腺肿瘤中miR-145表达差异不显著，在人乳腺癌也证明有不同的表达[3]。Ding Y等[18]通过RT-qPCR对乳腺癌和癌旁组织检测，同时发现miR-145过表达降低乳腺癌细胞增殖活力及抑制TGF-G1的表达，沉默miR-145反而增强。Zhao H等[19]已经证明，BT-IC分化所必需的胰岛素受体底物-1(IRS-1)是miR-145的直接靶标，miR-145显著性降低RTKN蛋白表达，从而抑制细胞生长和诱导细胞凋亡。miR-145在乳腺癌作为抑癌基因，直接靶向FSCN-1，阻断Oct4的表达，抑制EMT的转移。

3.4 miR-34a

miR-34a是多种类型癌症中表达下调的若干种miRNA之一，已被证明由p53转录调控。Kato M等[20]发现与正常上皮细胞系和HER2+细胞系相比，三阴性和间充质乳腺癌细胞系的miR-34a水平较低，结果表明乳腺癌亚型中的p53突变可能有助于低miR-34a表达。为了进一步阐明这些细胞中miR-34a和放射敏感性之间的关系，比较正常乳腺上皮细胞系(HMEC)，HER2+(UACC812)和间充质细胞系(MDA-MB-231)的敏感度，发现与HMECs或UACC-812(具有高miR-34a水平)相比，MDA-MB-231细胞系(具有低miR-34a水平)对辐射诱导更敏感，增加miR-34a的水平能保护MDA-MB-231细胞免受辐射诱导的细胞死亡，下调miR-34a具有相反的作用，由于miR-34a水平能影响乳腺癌细胞的辐射敏感性，因此miR-34a可能具有很大的乳腺癌治疗潜力。Li L等[21]研究发现与正常上皮细胞系184A1相比，其miR-34a表达水平在5种不同的乳腺癌细胞系中下调，miR-34a能够通过下调Bcl-2和SIRT1抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和诱导细胞凋亡。Losiewicz K等[22]发现与正常的犬乳腺组织相比，RT-qPCR结果显示miR-34a在乳腺癌中下降2.5倍，在肉瘤、良性肿瘤和非肿瘤病变中下降5倍，miR-34a异常表达与乳腺肿瘤的早期诊断相关。

3.5 miRNA-125

miR-125有2种已知的同种亚型，即miR-125a和miR-125b。Iorio M V等[4]和Osaki T等[16]研究发现与正常乳腺组织相比，在犬和人类乳腺癌患者中发现miR-125a和miR-125b均明显下调。Guo X等[23]研究表明miRNA-125a与各种乳腺癌细胞系中的HuR表达呈负相关，过表达miR-125a导致HuR蛋白水平降低，抑制细胞生长，并减少细胞迁移和增殖，miR-125a可以通过利用HuR作为直接和功能靶标潜在协助抑制乳腺癌。进一步的研究表明，miR-125a和miR-125b在HER2的扩增或HER2过表达的乳腺癌中显示下调。miR-125a和miR-125b作为抑癌基因，在SKBR3细胞(HER2过表达的人类乳腺癌细胞系)中过表达，抑制HER2 mRNA和蛋白质水平，导致减少细胞生长、运动和侵袭，然而，这种影响在非转化的HER2非依赖性乳腺癌细胞(MCF10A)中是微妙的。Sun Y 等[24]发现TSTA3在乳腺癌细胞和组织中高表达，与TNM分期、患者的生存期密切相关，miR-125b和miR-125a-5p在3′UTR区域共同调节TSTA3的表达，miR-125b和miR-125a-5p与肿瘤的生长、侵袭、转移相关。

3.6 miRNA-10b

miR-10b作为一种抑癌基因，阻止乳腺癌的发展，以及作为一个癌基因，引起乳腺癌的侵袭和转移，Osaki T等[16]和Losiewicz K等[22]发现miR-10b表达在犬乳腺肿瘤中增加。Ma L等[25]miR-10b在转移性乳腺癌细胞中高度表达，在体外miR-10b被twist转录因子激活，引起HOXD10mRNA翻译的中断，这导致RhoC的表达增加，其促进细胞侵袭和转移；与几乎不具有转移能力的MCF-7细胞系相比，转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞系miR-10b表达水平明显更高；与非转移性对照SUM149细胞的肿瘤相比，将miR-10b转导入非转移性SUM149和SUM159原位植入小鼠乳腺，显示miR-10b表达组表现出更多的癌细胞侵袭和一些呈现肺转移；miR-10b拮抗剂组癌细胞侵袭转移显著抑制。Bahena O I等[26]发现miR-10b在乳腺癌细胞中的过表达可以抑制PTEN的表达，激活AKT信号的活性，促进细胞中EMT和干细胞标志物的表达，从而促进乳腺癌侵袭和转移。Han X等[27]研究发现miR-10b表达的靶基因TGF-β1可促进TGF-β1诱导乳腺癌细胞EMT的发生，miR-10b表达的抑制可以部分逆转EMT，并减弱癌细胞的增殖和侵袭能力。

3.7 miR-21

miR-21是与乳腺癌细胞侵袭和转移相关的重要miRNA，在包括乳腺癌在内的各种实体肿瘤中表达上调，它在促进肿瘤发展中发挥作用。Iorio M V等[4]、Osaki T等[16]和Losiewicz K等[22]研究发现与正常乳腺组织相比，已经发现miR-21在乳腺肿瘤中显著过度表达，并且与晚期阶段，淋巴结阳性和存活时间减少有关；随后的研究也证明miR-21的作用不仅在其作为生物标志物的活性中起重要作用，而且作为功能靶标。Zhao H等[19]进一步探索miR-21在乳腺癌发展和进展中的作用，用anti-miR-21寡核苷酸转染MCF-7乳腺癌细胞的研究发现体外细胞生长减少和在异种移植小鼠模型中体内肿瘤生长被抑制。Chen Z等[28]和Fang H等[29]研究已经证实miR-21影响多个靶点，包括PDCD4，TPM1，maspin和PTEN基因。然而，尽管miR-21的上调与侵袭性肿瘤相关，但仍然没有靶标基因如PTEN和PDCD4的明确模型。miR-21是一种致癌miRNA，不仅在肿瘤生长中发挥作用，而且在靶向多种抗转移基因的侵袭和转移中起作用，进一步的研究应该探讨miR-21靶标，以利于更好的乳腺癌的靶向治疗。

3.8 miRNA-155

miR-155是表现出癌基因性质的miRNA，在乳腺癌细胞中的表达明显增加。Kong W等报道miR-155通过RhoA基因可以激活TGF-β/ Smad4信号，从而促进EMT。相反，miR-155的敲除可以显著抑制TGF-β/ Smad4诱导的EMT。在乳腺癌细胞系中SOCS1已被确定为miR-155的靶标，SOCS1的表达与miR-155的表达呈负相关。miR-155过表达增强乳腺癌细胞的增殖和体内肿瘤的发展。此外，在乳腺癌细胞中沉默SOCS1重新建立了miR-155的致癌作用，而恢复SOCS1表达促进了miR-155的促肿瘤生长功能，表明miR-155负调节SOCS1[30]。Kong W等[31]研究发现乳腺癌中miR-155负调控靶向FOXO3a，miR-155过表达导致抑制FOXO3a表达以诱导EMT，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号，并下调RhoA表达，从而诱导细胞存活和增强癌细胞的耐药性，并且miR-155的敲除，导致FOXO3a增加，诱导细胞凋亡和化学敏感性的增加，这项研究表明，乳腺癌细胞系miR-155与FOXO3a之间存在逆向相关性，提示miR-155是乳腺癌中必不可少的治疗靶点。

3.9 miRNA-221和miRNA-222

miR-221和miR-222都被鉴定为基底样乳腺癌亚型特异性miRNA，两种miRNA作为EMT的调节因子，引起细胞迁移和侵袭增加。Hwang M S 等[32]研究发现，miR-221和miR-222抑制靶标TRPS1表达，相反增加ZEB2表达。Alamolhodaei N S等[33]进一步的研究显示，miR-221和miR-222差异表达，两种miRNA在雌激素受体阴性(ER-)乳腺癌中过表达，而这些miRNA在乳腺癌中的过表达有助于侵袭性的基底样乳腺癌的进展，抑制细胞周期抑制蛋白p27/Kip1和p57，导致细胞增殖增加，这些特征也有助于他莫昔芬在基底型乳腺癌中的耐药；将miR-221和miR-222合成模拟物转染到非转化乳腺细胞系MCF10A中导致诱导的EMT样表型，增加侵袭和迁移，并增加间充质标志物vimentin表达。此外，抑制转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞系中的miR-221和miR-222出现反向表型，因此，两种miRNA在促进临床侵袭性基底样乳腺癌中起着重要作用。

3.10 其他miRNA

Hannafon B N等[34]发现致癌基因miR-182和miR-183在导管原位癌(DCIS)中过表达，抑制miR-182和miR-183导致其4种靶基因(CBX7、DOK4、NMT2和EGR1)的上调，同时又导致E钙黏蛋白表达的上调，这表明敲除这2种miRNA可能对乳腺癌恢复正常的上皮细胞形态具有重要的意义。Rybicka A 等[35]发现miR-214在犬乳腺细胞系(CMT-12、CMT-27、CMT-128)中下调但是与正常乳腺组织相比，miRNA基因芯片分析显示miRNA-183在犬乳腺肿瘤SNP细胞低表达，下降比率为0.190 3。Wang F等[36]研究发现与其在非恶性乳腺上皮细胞系MCF-10A中的表达水平相比，在4种人乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、 MDA-MB-453 和T47D)miR-214的表达上调。此外，miR-214的过表达显著增加了细胞活力，并消除了血清饥饿引发的凋亡，表明miR-214在乳腺癌细胞生长中起关键作用。此外，通过生物信息学分析和双萤火虫荧光素酶报告基因测定，PTEN被证实作为miR-214的直接靶标；重要的是，缺乏3′非翻译区(3′UTR)的PTEN cDNA的引入显著抑制miR-214诱导的PI3K/Akt信号通路的激活，并且消除了miR-214对细胞存活和抗凋亡的保护作用，这些发现表明miR-214具有致癌活性，其作用是通过靶向PTEN-PI3K/Akt途径促进细胞生长而介导的。因此，针对miR-124的药物干预可为乳腺癌的治疗提供有希望的治疗策略。

4 miRNA在肿瘤诊断中的研究前景

肿瘤标志物在乳腺肿瘤早期诊断、预防、药效评价及预后评价等方面发挥着极其重要的作用。但miRNA在犬乳腺肿瘤的早期诊断研究还处于起步阶段，同时在人类乳腺癌中还有很多复杂的机制尚未完全清楚。随着miRNA作用机制及与肿瘤之间关系的进一步深入研究，对肿瘤特异的miRNA表达谱的分析、确立，以及miRNA临床检测方法的不断完善，以实现miRNA对人类及犬乳腺肿瘤的早期诊断和预后评估，从而为人类和犬乳腺肿瘤带来新的预防、诊断和治疗手段。

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