包载盐酸小檗碱的磷脂/壳聚糖自组装纳米粒构建及表征

张世彩，陈坤，刘黎瑶,2，通信作者



包载盐酸小檗碱的磷脂/壳聚糖自组装纳米粒构建及表征

张世彩1，陈坤1，刘黎瑶1,2，通信作者

（1. 天津农学院 基础科学学院，天津 300384；2. 北京协和医学院药物研究所，清华大学医学部，北京 100050）

磷脂/壳聚糖自组装纳米粒（lecithin/chitosan nanoparticles，L/CS NPs）是通过磷脂与壳聚糖的静电作用而自组装形成的一种特殊聚电解质复合物，可作为药物载体，有利于提高难溶性药物的口服利用度。本研究中，以难溶性药物盐酸小檗碱为目标递送药物，构建了包载盐酸小檗碱的磷脂/壳聚糖自组装纳米粒，并建立了包封率测定方法。通过正交设计，以包封率为指标，筛选出制备载药自组装纳米粒的最优处方，其中水相pH值为8.0、乙醇∶水＝8∶92、磷脂∶壳聚糖＝20∶1。在优选处方下，制备的载药自组装纳米粒的平均粒径为（214.8±9.3）nm、Zeta电位为（24.3±3.1）mV、包封率为（82.4±5.2）%，4 ℃下可稳定存放3个月。该研究为后期实际应用奠定了基础。

自组装纳米粒；盐酸小檗碱；药物递送；正交设计；处方筛选

近年来，随着胶体微粒载体在药物制剂中的应用，自组装纳米粒载体[1]的构建和表征获得了快速发展。在构建这类载体的材料中，无毒无害的天然来源材料逐渐成为有代表性的一大类，该类天然材料如磷脂、壳聚糖，释药性能优良，构建的磷脂/壳聚糖自组装纳米粒[2-3]能显著改善难溶性药物的溶解性，增进药物的生物利用度，可用于经口、皮及眼部等多种药物递送系统的研究。

小檗碱是一种异喹啉类生物碱，主要存在于黄连、黄柏等药用植物中。临床广泛应用于胃肠道细菌感染等疾病的治疗，并且有大量文献报道其在治疗肿瘤、心血管类疾病方面也具有广泛的生理疗效[4-5]，有较高的潜在开发价值。虽然小檗碱多以盐酸盐形式存在，但水溶性差，口服给药之后药物的体内吸收率低，药物疗效难以发挥。目前，对于盐酸小檗碱的药物递送系统方面的研究尚未深入。因此，在本项研究中，基于磷脂/壳聚糖的自组装作用，建立将盐酸小檗碱包载入该自组装纳米粒中的方法，并对其理化性质进行初步表征。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

台式低速离心机（L550，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；高效液相色谱仪（日立，Primaide 1410UV，日本日立公司）；粒度仪和电位仪（NICOMP 380 ZLS Partical Sizing Systems和美国Santa Barbara，CA）；电子天平（METTLER TOLEDO，美国）；超滤离心管（Amicon Ultra-4，100KD和Millipore）；恒温磁力搅拌器等。

1.2 试剂

盐酸小檗碱（昆明雅阁臣药业有限公司）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：159238）；壳聚糖（Fluka，脱乙酰度85.0%）；Triton X-100（LR，美国Sigma公司）；乙腈、无水乙醇均为色谱纯；醋酸、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 色谱条件

参考2015版中国药典（二部），采用高效液相色谱法（RP-HPLC）测定盐酸小檗碱含量。具体色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液（使用磷酸调节pH 值至2.8）-乙腈（75∶25）；柱温：40 ℃；流速：1.00 mL/min；检测波长：345 nm；进样量：10.0 μL。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性试验

取处方量的磷脂、壳聚糖溶液以及盐酸小檗碱，加入0.1% Triton X-100乙醇溶液溶解，并加入流动相稀释定容，按照色谱条件进样HPLC分析，依法测定，考察空白辅料对药物测定的影响。

2.2.2 绘制标准曲线

精密称取盐酸小檗碱对照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入少量0.1% Triton X-100乙醇溶液溶解，并加入流动相稀释定容至刻度，配制成100 μg/mL的储备液。分别精密量取0.5、2.0、5.0、8.0、10.0 mL储备液至10 mL容量瓶中，加入流动相配制成质量浓度为5、20、50、80、100 μg/mL的标准溶液。按照色谱条件进样HPLC分析，依法测定，记录色谱峰面积。以峰面积（）对质量浓度（，μg/mL）进行线性回归，绘制标准曲线，并且拟合回归方程。

2.2.3 精密度试验

取上述低、中、高浓度的线性样品连续进样6次，记录色谱峰面积，并计算相对标准偏差（RSD值）。

2.2.4 回收率试验

准确称量10 mg盐酸小檗碱对照品以及处方量的磷脂、壳聚糖，置于100 mL容量瓶中，加入少量1%Triton乙醇溶液使其充分溶解，之后，用流动相稀释并定容至刻度，配制成100 μg/mL的储备液。分别准确量取0.5、5.0、10.0 mL储备液至10 mL的容量瓶中，加入流动相稀释并定容至刻度，分别配制成质量浓度为5、50及100 μg/mL的供试液。进样10.0 μL，进行HPLC测定，考察在试验条件下低、中、高3个浓度水平药物测定的回收率。

2.3 空白磷脂/壳聚糖自组装纳米粒的构建

参考文献[6-7]，选用大豆磷脂（S45）和壳聚糖（CS），制备不同质量比例的S45/CS NPs。首先，设定S45与CS的质量比分别为10∶0、10∶1、20∶1及40∶1；其次，选择无水乙醇作为有机相的溶剂。将目标质量的S45置于8 mL无水乙醇中，充分溶解，得到目标乙醇相。预先使用1%醋酸水溶液溶解壳聚糖，配制成1%（/）CS母液，在制备纳米粒时，取适当体积的母液稀释至92 mL，即可得到目标水相。在磁力搅拌条件下，用注射器以一定的注射速度，将乙醇相注入至水相中，注入结束之后，继续保持磁力搅拌30 min。

2.4 磷脂/壳聚糖自组装纳米粒性质表征

2.4.1 粒径分布测定

S45/CS纳米粒的粒径用激光粒度仪（PSS）测定，光源为大功率红色激光二极管，测量角度90°，激光波长639 nm，测量温度23 ℃。取适量纳米粒混悬液，用水稀释至固体浓度为0.01%～0.10%后，放入样品池中，测定粒径。

2.4.2 Zeta电位测定

取适量的S45/CS纳米粒混悬液，用水稀释至固体浓度为0.06%～0.60%，放入样品池中，插入电极，电场强度设为10 V/cm，电极距离为0.4 cm，测量温度为23 ℃，测定其Zeta电位值。

2.5 载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒的构建

2.5.1 正交设计筛选处方

通过前期单因素试验，发现水相pH值、乙醇相/水相体积比、S45/CS质量比对于载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒的性质具有较大影响。因此，拟通过三因素三水平（L9，34）正交设计，对载药自组装纳米粒的制备进行处方筛选。因素与水平设计见表1。在制备过程中，将制备总体积均设定为100 mL。

表1 正交设计因素与水平

2.5.2 筛选的考察指标

对于载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒，本试验以包封率为考察指标，包封率[8]的具体测定方法为：使用HPLC-超滤离心法，测定载药自组装纳米粒中包封药物的含量。量取2 mL待测样品溶液至超滤内管中，于4 000 r/min条件下离心40 min，取超滤液，按照盐酸小檗碱含量的测定方法，进行HPLC分析，记录峰面积，采用外标法，计算得到所测定样品中游离药物的质量free。

准确量取2 mL待测样品溶液至预先称重的干燥西林瓶中，冻干，再次称重，前后质量差值即待测样品溶液中纳米粒的总质量total。

按如下公式[7]，对载药量（）以及包封率（）进行计算。

其中，entra＝insulin-free。

2.6 载药自组装纳米粒的性质表征

在优选的处方设计下，制备3批包载盐酸小檗碱的磷脂/壳聚糖自组装纳米粒，于4 ℃条件下密封放置0、1、2、3个月，分别测定其粒径分布、Zeta电位以及包封率。

3 结果与分析

3.1 盐酸小檗碱含量测定

3.1.1 专属性试验

按照既定色谱条件进样HPLC分析，依法进行专属性试验，色谱图如图1所示。结果表明：载药自组装纳米粒中的主要辅料——大豆磷脂和壳聚糖，不干扰主药的测定。

图1 空白辅料（A）以及盐酸小檗碱-辅料混合物（B）的HPLC图谱

3.1.2 线性分析

按照既定的试验方法，配制不同浓度盐酸小檗碱对照品系列溶液，按照色谱条件进样HPLC分析，依法测定，记录色谱峰面积。结果表明：以峰面积（纵坐标，）对浓度（μg/mL，横坐标，）进行线性回归，回归方程为= 78.851- 150.38（2= 0.998 2）。线性测定结果（图2）表明，在既定测定方法下，盐酸小檗碱对照品在5.0～100.0 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

图2 盐酸小檗碱对照品标准曲线

3.1.3 精密度试验

按照既定的试验方法，低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的精密度测定结果如表2所示。

测定结果表明，对低、中、高浓度对照品溶液分别连续重复6次测定的值均小于2%，表明该方法的精密度良好。

表2 精密度试验结果

3.1.4 加样回收率试验

依法对盐酸小檗碱对照品的回收率进行测定，测定结果如表3所示。表3表明，在既定的测定方法下，低、中、高浓度样品的回收率均在90%～110%范围内，并且平均回收率的值均小于2%，表明既定测定方法的回收率合格。

表3 加样回收率测定结果

3.2 正交设计进行载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒的处方筛选

通过三因素三水平（L9，34）正交设计，以包封率作为评价指标，筛选出载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒制备的最佳处方，正交分析结果如表4所示。

表4 载药自组装纳米粒处方筛选正交试验结果

根据分析结果可知，影响载药磷脂/壳聚糖自组装纳米粒包封率的3个因素主次顺序是A＞B＞C，即最主要的因素为水相pH值，其次是乙醇相/水相体积比，影响最小的是S45/CS质量比。通过极差分析得出最优处方组合为A3B3C2，即水相pH值为8.0、乙醇相/水相体积比为8∶92、S45/CS质量比为20∶1。

3.3 优化处方下载药自组装纳米粒的性质表征

为考察上述优选处方的工艺稳定性，按照最优处方条件制备了3批载药自组装纳米粒，对其初步进行了放置稳定性评价以及性质表征，结果如表5所示。表5表明，优选处方下，所制备的载药自组装纳米粒的平均粒径为（214.8±9.3） nm、Zeta电位为（24.3±3.1）mV、包封率为（82.4±5.2）%。

于4 ℃的保存条件下，载药纳米粒放置3个月以内的稳定性良好，粒径、Zeta电位以及载药量未发生显著变化。

表5 载药自组装纳米粒的放置稳定性评价（4 ℃）

4 讨论

在前期研究中，采用相同的物料比例以及试验条件，使用不同pH值的水相制备得到了空白自组装纳米粒，其粒径及Zeta电势情况并未出现显著性差异。而在载药自组装纳米粒的处方筛选过程中，发现在不同水相pH值条件下，制备所得的载药自组装纳米粒的包封率具有较大差异。针对该现象，认为是由于盐酸小檗碱在水相溶液中的溶解度，受到pH值的影响。当水相的pH值处于酸性范围内时，盐酸小檗碱在其中的溶解度较高，容易从乙醇相中转移至水相中，在自组装制备载药纳米粒时，药物不易被包封在纳米粒内部，造成载药自组装纳米粒的药物包封率低下。

此外，为了增加盐酸小檗碱在乙醇相中的溶解度，向其中加入了0.1%的Triton X-100作为增溶剂，以得到澄清透明的溶液，考虑到Triton X-100的安全性，后期会筛选其他适宜的表面活性剂对其进行替代[12]。

在本项研究中，最终选择了水相pH值为8.0、乙醇相/水相体积比为8∶92、S45/CS质量比为20∶1的条件来制备载药自组装纳米粒，考虑到本制剂的后期给药途径拟设定为口服给药，鉴于对本制剂的酸碱性有一定要求，因此并没有为了提高包封率而无限制地提高水相的pH值。在之后的研究中，会对制剂处方进行进一步的优化，以期达到良好的实用目的。

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责任编辑：宗淑萍

Preparation and evaluation of self-assembled lecithin/chitosan nanoparticles for berberine hydrochloride delivery

ZHANG Shi-cai1, CHEN Kun1, LIU Li-yaoCorresponding Author

（1. College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College & Tsinghua University, Beijing 100050, China）

With the development of nano-medicine, a novel kind of self-assembled nanoparticle was fabricated through electrostatic crosslink method using negative-charged lecithin and positive-charged chitosan. This kind of self-assembled nano-carrier could be used to improve oral bioavailability of drugs with poor solubility. In this study, we utilized this nano-carrier to facilitate the drug delivery of berberine hydrochloride, whose water solubility is low to 1:200（g:mL）. At the same time, the method for entrapment efficiency（）measurement was established. Afterwards, orthogonal screening was used to determine the optimal formulation of drug-loaded self-assembled nanoparticle, in which entrapment efficiency（）was set as evaluation indicator. In the selected formulation, pH value of water phase was 8.0, volume ratio of ethanol phase/water phase was 8∶92, and mass ratio of lecithin/chitosan was 20∶1. Three batches self-assembled nanoparticle were prepared under the selected formulation, and evaluation results showed that the average particle size, Zeta potential and entrapment efficiency was（214.8±9.3）nm,（24.3±3.1）mV and（82.4±5.2）%, separately. Berberine hydrochloride loaded self-assembled nanoparticle remains high stability under 4 ℃storage, which provided the basis for practical application.

self-assembled nanoparticle; berberine hydrochloride; drug delivery; orthogonal screening; formulation selection

P641.131；S152.72

A

1008-5394（2018）01-0059-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.013

2017-12-22

中央高校基本科研业务费专项资金资助-协和青年基金资助（3332015044）；国家自然科学基金面上项目（31170442）

张世彩（1996-），女，本科在读，主要从事难溶性药物增溶方面的研究。E-mail：31005147@qq.com。

刘黎瑶（1988-），女，讲师，博士，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：llymeilin@163.com。