黄晗达,杨静慧,龚无缺,刘艳军,王茂思,王葳
7个樱桃品种亲缘关系的RAPD分析
黄晗达,杨静慧通信作者,龚无缺,刘艳军,王茂思,王葳
(天津农学院 园艺园林学院,天津 300384)
研究不同樱桃品种的亲缘关系,为樱桃的引种栽培提供理论依据。以7个樱桃品种为研究对象,利用改良CTAB进行DNA提取,通过PCR进行RAPD扩增,对7个樱桃品种进行DNA多态性分析和RAPD产物的相似系数统计和聚类分析。通过20个随机引物的筛选,发现多态性效果较好的有4个引物,获得了100个DNA扩增片段(120~2 000 bp),表现出明显的多态性,多态率达到87%。UPGMA聚类分析结果表明,7个樱桃品种分为4类,黄果实MZ为一类,黑果实BLA为一类,深红果实AM、RED为一类,EBF、mSUM、SUM为一类。亲缘关系最远的是BLA和MZ,相似系数为0.400,亲缘关系最近的是SUM和mSUM,相似系数为0.990。
樱桃;RAPD;亲缘关系;遗传距离
樱桃((Lindl.)G. Don)原产于欧洲东部和亚洲西部[1],是我国华北地区落叶果树中成熟最早的树种,享有“春果第一枝”的美称[2]。樱桃果实圆润、色泽鲜艳、味美,含有丰富的蛋白质、维生素、胡萝卜素及其他微量元素,每百克鲜果樱桃里含铁6~8 mg,居水果之首,维生素A含量是苹果和橘子的5~6倍。樱桃还含有丰富的保健成分,所含的花青素、原花青素、褪黑激素、花色苷具有抗衰老、抗氧化、修复组织损伤、抗炎症、抗肿瘤的功效[3]。樱桃在中国水果种植中属于小作物,栽培面积不大。近几年,酸甜可口、营养丰富的樱桃备受消费者青睐,樱桃进口势头很猛。2015年进口量为9.3万t,进口额为6.8亿美元,超过火龙果、葡萄、榴莲、柑橘等水果,成为世界第二大进口水果,仅次于香蕉[4]。此外,樱桃植株本身因其造型优美而广泛用于园林观赏。樱桃植株的叶片和茎也是良好的中药材[5]。
目前,分子标记被广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面[6]。利用RAPD-PCR技术对蔷薇科果树的种质资源鉴定已有较多报道,如1993年Koller采用RAPD技术对苹果属的种质遗传资源进行了鉴定[7];艾呈祥等[8]对20个国外品种和10个中国樱桃品种的遗传多样性进行了分析;宋常美等[9]采用RAPD-PCR技术对贵州地区樱桃种质资源的多样性进行了分子评价;刘超等[10]利用形态学与RAPD标记研究了‘龙亭’樱桃、中国樱桃及福建樱桃的亲缘关系;赵菲佚等[11]利用改良CTAB法进行了 DNA提取,使用RAPD- PCR技术建立了大樱桃品种分子鉴定图谱。蔡宇良等[12]通过RAPD对樱桃种质资源的遗传特性进行了分析。因此,通过叶片细胞DNA的RAPD多态性分析,可以比较和了解不同品种间的亲缘关系,从分子水平揭示品种间的系统关系。同时,可以进行生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究及遗传图谱构建、植物药材相近种类的鉴定等。
本研究以天津市现阶段主栽的7个樱桃品种为研究对象,利用RAPD-PCR技术分析7个樱桃品种之间的亲缘关系,以了解其习性,为生产上的引种栽培和育种提供理论依据。
美早(AM)、黑珍珠(BLA)、萨米特(SUM)和矮化萨米特(mSUM)、红灯(RED)、早大果(EBF)和明珠(MZ),共计7个品种。由天津农学院园艺园林学院园林植物教研室提供,砧木是乔化砧‘马哈利’,栽植于天津市蓟州区上仓镇郑家套村,每品种栽植3行,每行7株,株行距为2.5 m×4 m。各品种嫁接的一年生苗于2010年11月定植,果林为南北朝向栽植。试验地土壤为黏壤土,pH 6.2,土壤含盐量为0.15%,土壤肥力中等。果园实施常规管理。
于2015年秋季随机采集植株外围的成熟叶片,采用改良CTAB法提取樱桃叶片的基因组DNA。
试验所用RAPD-PCR试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。体系优化包括模板浓度优化和退火温度优化。优化后的反应体系为:总体积25 µL,RAPD引物1 µL,dNTP0.5 µL,10×PCR buffer 2.5 µL,ddH2O19.5 µL,酶0.5 µL,DNA模板1 µL。预变性:94 ℃,4 min;循环次数:42次(变性:94 ℃,30 s;退火:37 ℃,30 s;延伸:72 ℃,80 s);延伸:72 ℃,10 min;终止温度:4 ℃。
琼脂糖凝胶电泳,agarose胶浓度为1.2%,电泳方法见表1。
表1 DNA样品及其PCR产物电泳方法
RAPD条带分析和数据处理:将电泳图谱上同一位置上DNA条带的有无进行统计,有带记为“1”,无带记为“0”,形成1、0数据矩阵,计算各条引物的扩增条带、多态性条带以及多态性百分率[12]。根据公式=/(+)计算遗传相似系数,其中,、是样本和PCR扩增产物的DNA条带总数,是样本和PCR扩增产物的共有条带数[13]。用NTsys2.1软件进行数据分析,生成聚类图。
用20 条引物进行扩增,从中筛选出 4 条扩增效果好的引物(表2),分别对所有样品进行扩增。
表2 筛选出的4条引物及其序列
4 条引物对樱桃不同品种基因组DNA进行扩增所得条带的相对分子质量集中在120~2 000 bp之间,共扩增出100条带(图1和表3),其中共有87条多态性条带,多态率达到87%,多态性较好;平均每条引物扩增条带数为25条,平均多态性条带数为21.75条。不同引物扩增出的条带数、多态性条带数及多态百分率各不相同,B4号引物扩增出的条带数最多为31条,其次是B11号引物扩增出的条带数为27条,然后是B15号引物扩增出的条带数为26条,最少的是B9号引物扩增出的条带数为16条。同时,每种引物所产生的多态性都非常丰富,其中B11 的多态性条带百分率达到了96.3%,其次是B9多态性条带百分率为87.5%,再次是B4多态性条带百分率为83.9%,最低的是B15多态性条带百分率为80.8%。这充分说明各个樱桃品种在RAPD分子水平上具有丰富的多态性。
图1 不同引物对樱桃基因组DNA的扩增结果
注:A:AM;B:BLA;C:SUM;D:mSUM;E:EBF;F:MZ;G:RED;a:B4引物对不同樱桃品种DNA基因组扩增图;b:B9引物对不同樱桃品种DNA基因组扩增图;c:B11引物对不同樱桃品种DNA基因组扩增图;d:B15引物对不同樱桃品种DNA基因组扩增图
表3 RAPD引物对不同樱桃品种叶片DNA扩增的条带数统计
UPGMA聚类分析的结果表明(图2),试验中的樱桃品种可以分类为4类,黄果实MZ为一类,黑果实BLA为一类,深红果实AM、RED为一类,EBF、mSUM、SUM为一类。
图2 不同樱桃品种聚类图
从表4中可知,7个樱桃品种中SUM和mSUM的亲缘关系最近,相似系数为0.990。同一类品种的樱桃果实相似系数均较高,而非同一类品种的樱桃果实则遗传相似系数较低,MZ与BLA的相似系数最低,为0.400,MZ与AM的相似系数为0.520,MZ与RED的相似系数为0.533,MZ与EBF的相似系数为0.544,MZ与SUM、mSUM的相似系数均为0.656。BLA与AM的相似系数为0.800,BLA与RED的相似系数为0.867,BLA与EBF的相似系数为0.877,BLA与SUM的相似系数为0.841,BLA与mSUM的相似系数为0.840。AM与RED的相似系数为 0.933,AM与EBF的相似系数为0.854,AM与SUM的相似系数为0.874,AM与mSUM的相似系数为0.871。RED与EBF的相似系数为0.875,RED与SUM的相似系数为0.862,RED与mSUM的相似系数为0.864。EBF与SUM的相似系数为0.911,EBF与mSUM的相似系数为0.912。
表4 不同樱桃品种遗传相似系数矩阵
从分子角度来说,遗传多样性越高,遗传背景越复杂,该物种存在的历史也就越长。遗传距离变幅越大,说明该物种遗传分化越大。刘超等[10]研究表明,‘龙亭’樱桃和福建樱桃在相似系数0.668处首先发生聚类,在0.595处与中国樱桃发生聚类,说明‘龙亭’樱桃与福建樱桃亲本的亲缘关系较近,与其他中国樱桃亲缘较远。高天翔[14]研究表明,14个野生中国樱桃居群的遗传多样性水平较高,其中凤凰山居群多样性水平最高。艾呈祥等[8]研究发现,中国樱桃品种群的遗传多样性更为丰富,中国樱桃的相似系数普遍低于欧洲甜樱桃,中国樱桃的相似系数为0.522 4~0.711 6,而欧洲甜樱桃的相似系数为0.588 7~0.865 4,说明中国樱桃品种间的遗传相似性都很小。本试验中,MZ、BLA为中国自主选育的樱桃品种,AM、RED、EBF为引进的欧洲甜樱桃品种,SUM和mSUM为加拿大甜樱桃,经过RAPD多态性分析显示:试验中的樱桃品种可以分为4类,黄果实MZ为一类,黑果实BLA为一类,深红果实AM、RED为一类,EBF、mSUM、SUM为一类。mSUM为SUM的矮化品种,EBF为乌克兰樱桃品种,分析结果将这3类聚为一类。AM、RED分别由‘斯坦拉’和‘意大利’、‘那翁’和‘黄玉’杂交所得,这4个亲本品种均为欧洲原产的甜樱桃。中国自主选育的MZ和BLA与其他供试品种地理间隔较远,遗传相似性不高。本试验结论与前人提出的欧洲樱桃品种间的亲缘关系基本一致。
MZ是大连市农业科学研究院选育的早熟、个大、鲜食品质优良的黄果实樱桃品种,其主要栽培地区为辽宁、河北、山东、山西[15]。BLA是1993年重庆南方果树研究所从中国樱桃芽变品种中筛选出的优良品种[16]。本试验结果表明,BLA和MZ亲缘关系最远,相似系数仅为0.400,这在一定程度上反映了品种的地理分布状况,说明地理因素对品种有很大的影响。MZ多栽植于中国北方,BLA多栽植于中国南部,气候环境差异明显,地理距离遥远,这是造成MZ和BLA两个品种间遗传相似性很小的重要原因之一。这也说明我国樱桃栽植范围辽阔,地理距离较远的樱桃品种遗传相似性小,樱桃品种资源基因库丰富。
在樱桃引种、栽培、驯化的过程中合理运用植物亲缘关系,可以加快和精确指导生产工作。植物引种栽培时,首先运用相似分析法则,判定物种的原产地区与引种地区的生态环境相似度。本研究和前人研究证明,樱桃品种的亲缘关系在一定程度上反映了品种的地理分布状况,可以根据地区环境的相似度推断不同品种在该地区的适应性。其次运用类比推断法在引种地区找出与计划引种在樱桃分类上亲缘关系相近的参照品种,用以判断计划引种品种是否适合在本地区栽培。若本地区已经有与引种品种亲缘关系相近的樱桃品种栽培,并在本地区表现良好,则可以此参照品种对引种品种做出适应性的初步评估。引种品种评估推定为有一定适应性后,则可在当地进行实际栽培实验,通过驯化和适应就可以逐步推广。本研究对天津栽培的7个樱桃品种亲缘关系进行了分析,结合这7个樱桃品种在天津栽培生长的适应状况,依托亲缘关系相似度为天津引进其他樱桃品种提供参考和依据。
不同樱桃品种的RAPD多态性分析显示:本研究供试樱桃品种分为4类,黄果实MZ为一类,黑果实BLA为一类,深红果实AM、RED为一类,EBF、mSUM、SUM为一类。亲缘性最远的是BLA和MZ,相似系数为0.400,亲缘性最近的是SUM和mSUM,相似系数为0.990。
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责任编辑:杨霞
Analysis of genetic relationship of 7 cherry varieties by RAPD
GONG Wu-que, LIU Yan-jun,WANG Mao-si, WANG WeiCorresponding Author
(College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
In order to study the phylogenetic relationships among different cherry varieties and provide theoretical basis for the introduction and cultivation of cherry, RAPD amplification of seven varieties of cherries was performed by PCR. The DNA polymorphism of 7 cherry varieties and the similarity coefficient were analyzed by cluster method of RAPD products. Through the screening of 20 random primers, 4 primers with good polymorphism were found and 100 DNA amplification fragments were obtained, showing obvious polymorphism. The rate of polypeptide was 87%. Based on UPGMA cluster analysis, the tested cherry varieties can be classified into 4 types: MZ with yellow fruit, BLA with black fruit, AM and RED with dark red fruit, and the last catogary of EBF, mSUM and SUM. The kinship between BLA and MZ was the farthest with 0.400 similarity coefficient, while SUM and mSUM were the closest in kinship with 0.990 similarity coefficient.
cherry;RAPD; genetic relationship; genetic distance
S663.9
A
1008-5394(2018)01-0005-04
10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.002
2017-10-27
天津市农委项目(201502100);天津市科委项目(16YFZCNC00750)
黄晗达(1992 -),男,硕士在读,主要从事园艺和园林植物栽培研究工作。E-mail:845638957@qq.com。
杨静慧(1961-),女,教授,博士,主要从事园艺植物栽培、抗逆生理和分子育种研究。E-mail:jinghuiyang2@aliyun.com。