乳酸菌国家检验标准的更新

◎ 许再元

（中国广州分析测试中心，广东　广州　510070）

乳酸菌是一群能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。目前，已发现的乳酸菌可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。乳酸菌能寄生在人类、动物和植物中，其在发酵过程中的关键代谢产物是乳酸，当与其他代谢产物一块作用于人体时，可对人体健康起到有益的作用，所以在各类食品中，如酸奶、干酪、肉类、巧克力和各类保健药品中乳酸菌得到了广泛的应用[1]。在食品国家安全检测中GB4789.35-2010一直是乳酸菌检测的标准，最近更新为GB4789.35-2016版本，可见乳酸菌在人们日常食品生产、消费中起到重要作用。

1　乳酸菌国家标准检验的更新

根据乳酸菌检测国家标准，选用一个酸奶样品进行新旧标准整个实验流程的对比试验，使用的旧版为GB4789.35-2010，使用的新版为GB4789.35-2016。对所得试验结果和实验过程中的现象进行对比，分析新旧版标准的不同与改版的目的。

1.1　培养基的配制及对比

培养基的配制部分，改变并不大，主要使用了MC培养基、MRS培养基以及改良MRS培养基，其中新版的改良MRS培养基里多添加了半胱氨酸[2]。半胱氨酸是一种生物体内常见的氨基酸，也是一种还原剂。考虑到双歧杆菌严格厌氧的特性，半胱氨酸不但可以作为营养成分以供菌株培养，同时作为一种保护剂保护菌株防止其因氧气影响生长。

1.2　实验主要操作流程及对比

第一步依然是将样品用生理盐水稀释，然后接种到3种不同的培养基中，培养过后根据公式计数，最后选做鉴定。第一步稀释并没有改动，而在接种部分，2010版使用的是涂布0.1 mL的做法[3]，而2016版则使用1 mL倾注的方法[3]。在培养时间上，2010版的为（48±2）h，而2016版的则延长至（72±2）h[2-3]。就涂布与倾注而言，倾注法更为省事，但要求培养基的温度不能太高，需要控制在（46±1）℃，倾注法能将培养基包裹，使样品更好地隔绝空气，让改良MRS中的莫匹罗星锂盐更好地起到抑制乳杆菌的作用，加上半胱氨酸的保护作用，有助于双歧杆菌的生长，且避免了涂布时出现的重叠不均匀等现象，可操作性更高。在取样量上，1 mL比0.1 mL更有代表性，不确定度更低。至于因培养时间改变引起的区别主要在于对平板菌落计数的时候，如果平板菌落较多，培养时间延长至72 h，最终可能难以计数，而对于平板上菌落数量较少的情况并没有太大影响。而在计数方面改动较大，将原来的公式从相减变为相加；同，2016版将根据样品含菌的不同分别计数，整体弥补了前几个版本在计数上的补足。而最后鉴定部分并没有太大的改动。

1.3　计数实验结果读取及对比

以某品牌酸奶为例，分别按照国标2010版与2016版进行实验，实验部分结果，分别见表1、2。

表1　10-5稀释度下10个平板的菌落数表

表2　10-6稀释度下10个平板的菌落数表

用T-test进行数据分析，10-5稀释度的P值为0.000048＜0.01，为极显著差异。10-6稀释度的P值为0.28＞0.05，无显著差异。

通过对平板上菌落数数据分析以及实验操作过程的分析，可以得到以下结果：在相同稀释度下，稀释倍数越低，平板菌落数越多，倾注法的菌落数量显著比涂布法多。分析其原因，主要在于2点：①倾注法平板同一点上由于立体的效果可出现多个菌落计数，同时在混合均匀的前提下不容易出现多个单菌落相连。②涂布法存在的堆叠、涂布棒损耗以及操作等因素，使得菌落数偏小。在相同稀释度下，稀释倍数越高，平板菌落数越少，倾注法的菌落数量与涂布法菌落数量相当，无显著差异。因此，在样品得到充分稀释的前提下，在计数结果上，新标方法能较准确地得出结果。

1.4　乳酸菌鉴定及对比

对于选做鉴定部分，新标与旧标相似，都是在计数结束后在原有的平板上挑取3个以上单菌落进行鉴定。使用旧标的方法，由于是涂布于培养基表面，挑取单菌落十分方便可行，而使用新标的方法就相对比较麻烦了。由于是倾注到培养基里面，虽有部分菌落可长在平板表面，但要挑取多个菌落时往往需要挑开原有的培养基。同时，如果同一平板菌落数较多且分布比较密集，要挑取到单菌落就比较困难。在挑取单菌落后，同样进行革兰氏染色、生化鉴定等试验。新旧标准同样面临相同的问题，对于比较复杂的样品（含有多种乳杆菌），很难全部一次鉴定出来，如只按照标准所述的生化鉴定方法，则干酪乳杆菌干酪亚种与鼠李糖乳杆菌难以区分。

2　对乳酸菌检验的一些想法

对于2016新版乳酸菌检验的改变，笔者认为更为贴近客观事实。但在最后鉴定部分依然还有商榷的地方，例如：为了更有效地进行鉴定，是否应该像GB4789.35-2016版双歧杆菌鉴定一样将计数与鉴定分离开来，如计数使用倾注法而鉴定使用涂布法。同时，对于产品的鉴定规定，只对使用单一菌种的产品进行鉴定[4]，而在生化鉴定方面，不只是规定使用表中生化试剂，而可以使用像API50CH这类商品化的生化试剂盒又或者微生物生化鉴定系统。除了生化鉴定，笔者认为还应添加分子生物学的方法进行鉴定，特别在鉴定细菌分类到种、亚种的时候，往往些许的变异就可以改变生化现象[5]。因此，引入像PCR、荧光PCR等分子方法十分重要，如16S rRNA基因间隔区（Intergenic Spacer Region，ISR）的序列分析技术[6]、限制性片段长度多态性分析技术（Re-striction FragmentLength Polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性分析技术（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、DNA芯片技术、肠细菌基因间重复共有序列分析技术（Enterobacte-rial Repetitive Intergenic Consensus Sequences，ERIC）以及重复基因外回文序列分析技术（Repetitive Extragenic Palindromic Sequences，REP）等，这些方法在乳酸菌分类检测方面都是有效可行的方法[1]。

参考文献：

[1]张家超，孙志宏，刘文俊，等.适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术[J].乳业科学与技术，2009（2）：89-93.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB4789.34-2016食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]Booysen C，Dicks L M T，Meijering I.Isolation identification and changes in the composition of lactic acid bacteria during the malting of two different barley cultivars [J].International Journal of Food Microbiology，2002（76）：63-73.

[6]Parola P，Maurin M，Alimi Y，et al. Use of 16SrRNA gene sequencing to identify Lactobacillus casei in Septicaemia Secondary to a Paraprosthetic Eenteric Fistula[J].European Journal Clinical Microbiology and Infectious Diseases，1998（17）：203-205.