FGF4在肺癌组织中的表达及其对肺癌细胞增殖、转移的影响

曲杰，林萍萍，吕喜英，李青山

(承德医学院，河北承德067000)

肺癌是世界上发病率和病死率最高的肿瘤，患者的5年生存率不到15%[1]。近年来，靶向药物在肺癌的治疗中成为一大热点。寻找新的靶基因，阐明肺癌的发生发展机制对治疗肺癌有重要的作用。多种肿瘤细胞膜上存在着成纤维细胞生长因子(FGF)受体，许多肿瘤细胞均有FGF及其受体基因表达，表明FGF可直接促进肿瘤细胞增殖[2]。Folkman等[3，4]认为，FGF4参与肿瘤的血管形成以促进肿瘤生长，说明FGF4在肿瘤细胞生长及肿瘤的血管生成中均扮演了极为重要的角色。目前，FGF4与肺癌细胞增殖和迁移的关系尚不明确。2013～2016年，我们观察了肺癌组织中FGF4的表达水平，并探讨FGF4过表达对肺癌细胞增殖和转移的影响，旨在为肺癌的基因治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

肺癌及癌旁组织购自西安奥美生物科技有限公司；人肺成纤维细胞株HFL1、人低转移肺癌细胞株NL9980、人高转移肺癌细胞株A549均购于ATCC。TRIzol、RNA酶抑制剂、RNA逆转录试剂盒及SYBR Green实时定量试剂盒均购自Invitrogen公司；PCR引物、shRNA由华大基因合成；Anti-FGF4抗体购自Proteintech Group；Western ECL发光试剂盒购自武汉三鹰公司；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。限制性内切酶EcoRI/XholⅠ、琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液购自Thermo公司；Taq DNA聚合酶、FastPful DNA聚合酶、DNA连接酶购自购北京全式金生物技术有限公司；DNA切胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自博迈德生物公司；RIPA购自Solibro公司。

1.2　肺癌组织及癌旁组织中FGF4 mRNA表达检测

采用RT-PCR法。将40例肺癌组织及其对应的癌旁组织捣碎，分别抽提总mRNA，取1 μg mRNA逆转为cDNA。以GAPDH为内参基因，设计并合成引物。FGF4上游引物5′-GAGCAGCAAGGGCAAG-CTCTA-3′,下游引物5′-ACCTTCATGGTGGGCGACA-3′；GAPDH上游引物5′-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游引物5′-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。读取基因扩增的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算FGF4 mRNA的相对表达量。

1.3　细胞培养

HFL1、NL9980、A549细胞均采用含10%小牛血清的DMEM培养液进行培养，培养条件为37 ℃、饱和湿度、5% CO2。

1.4　HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4 mRNA表达检测

采用RT-PCR法。取对数生长期HFL1、NL9980、A549细胞，分别抽提总mRNA，逆转录合成cDNA，所用引物同1.2，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共32个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR结束加6×loading buffer震荡混匀，取等量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。实验重复3次。

1.5　HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4蛋白表达检测

采用Western blotting法。取对数生长期HFL1、NL9980、A549细胞约106个，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，将蛋白质转至醋酸纤维素膜，加入8%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入FGF4鼠单克隆抗体(Santa Cruz，1∶1 000)及抗β-actin抗体(Sigma，1∶800)，4 ℃反应过夜。TBST液洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。TBST液洗涤，化学发光法检测FGF4蛋白表达，X线片记录结果。

1.6　过表达FGF4的NL9980稳定细胞株的构建

取NL9980细胞，利用Lipo2000转染构建过表达FGF4的稳定细胞株[6]。设计针对FGF4 mRNA全长的引物，上游5′-GGGAATTCATGTCGGGGCCCGGGACGGCCGCGGTAGCGC-3′,下游5′-CCCTCGAGTCACAGCCTGGGGAGGAAGTGGGTGACCTTC-3′。用FastPful DNA聚合酶扩增出目的基因，分别对表达载体pCDNA3.1和FGF4基因片段进行EcoRI和XholⅠ双酶切，酶连，转化，鉴定获得pCDNA3.1-FGF4重组质粒。由于pCDNA3.1上带有Neo抗性基因，所以FGF4稳定过表达的细胞株和空载pCDNA3.1细胞株采用G418(700 μg/mL)筛选，10 d后得到稳定表达FGF4的细胞株，即NL9980-FGF4-oe。阴性对照为只转染pCDNA3.1的NL9980细胞株，即NL9980-NC。

1.7　敲除FGF4的A549稳定细胞株的构建

取A549细胞。设计针对FGF4的siRNA序列，根据已发表文献有较好干扰效果的siRNA序列[5,6]：5′-CGAUGAGUGCACGUUCAAGdTdT-3′，3′-dTdTGCUACUCACGUGCAAGUUC-5′。将其克隆到pGFP-V-RS载体上，用2 μg/mL嘌呤霉素筛选，过程同1.6，得到稳定表达FGF4-shRNA的细胞株，即A549-FGF4-si。阴性对照为只转染pCDNA3.1的A549细胞株，即A549-NC。

1.8　细胞增殖能力观察

采用MTT法。将NL9980-NC、NL9980-FGF4-oe、A549-NC、A549-FGF4-si细胞各100 μL接种于96孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每种细胞设3个复孔。分别在培养第1、2、3天时加入MTT溶液，继续孵育4 h，然后终止培养，弃上清。加入DMSO，避光摇床振荡15 min。上酶联免疫监测仪，于490 nm波长处测定各孔吸光度A值。以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.9　细胞迁移能力观察

采用细胞划痕实验[7,8]。分别将NL9980-NC、NL9980-FGF4-oe、A549-NC、A549-FGF4-si细胞接种到6孔板，待细胞贴壁长满后使用探针进行划痕，PBS洗涤，更换为无血清培养基，分别在0、24 h时拍照，观察划痕愈合情况。

1.10　统计学方法

2　结果

2.1　肺癌组织及癌旁组织中FGF4 mRNA表达比较

肺癌组织及癌旁组织中FGF4 mRNA的相对表达量分别为1.39±0.14、0.21±0.11，肺癌组织中FGF4 mRNA表达高于癌旁组织(P<0.05)。

2.2　HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4 mRNA表达比较

HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4 mRNA的相对表达量分别为0.41±0.12、1.03±0.11、1.69±0.16，NL9980、A549细胞中FGF4 mRNA表达高于HFL1，且A549细胞高于NL9980细胞(P均<0.05)。

2.3　HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4蛋白表达比较

HFL1、NL9980、A549细胞中FGF4蛋白的相对表达量分别为0.30±0.08、0.96±0.10、1.56±0.13，NL9980、A549细胞中FGF4蛋白表达高于HFL1，A549细胞高于NL9980细胞(P均<0.05)。

2.4　FGF4过表达对NL9980和A549细胞FGF4蛋白表达的影响

NL9980-NC、NL9980-FGF4-oe、A549-NC、A54-FGF4-si细胞中FGF4蛋白表达分别为0.89±0.11、1.63±0.12、0.96±0.08、0.52±0.06，NL9980-FGF4-oe细胞的FGF4蛋白表达较NL9980细胞上升，A549-FGF4-si细胞的FGF4蛋白表达较A549细胞下降(P均<0.05)。

2.5　FGF4过表达对NL9980和A549细胞增殖能力的影响

NL9980-FGF4-oe细胞的增殖能力高于NL9980-NC,而A549-FGF4-si细胞的增殖能力低于A549-NC细胞。见表1。

表1　各细胞增殖能力比较

注：与NL9980-NC细胞比较，*P<0.05；与A549-NC细胞比较，#P<0.05。

2.6　FGF4过表达对NL9980和A549细胞迁移能力的影响

0 h时NL9980-FGF4-oe细胞、NL9980-NC细胞的划痕距离分别为(2.0±0.2)、(2.0±0.2)cm，24 h时分别为(10.6±0.2)、(6.2±0.1)cm，24 h时NL9980-FGF4-oe细胞的划痕距离大于NL9980-NC细胞(P<0.05)。0 h时A549-FGF4-si细胞、A549-NC细胞的划痕距离分别为(2.0±0.2)、(2.0±0.2)cm，24 h时分别为(4.5±0.1)、(7.6±0.3)cm，24 h时A549-FGF4-si细胞的划痕距离小于A549-NC细胞(P<0.05)。

3　讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤最基本的生物特征，是一个极其复杂、涉及肿瘤与宿主之间相互作用的多步骤的过程，受许多相关基因的调控。研究肿瘤转移发生过程中的潜在的分子机制具有重要意义[9]。FGF4已经被证明是癌基因，它涉及肿瘤的生长和转移。李江超等[10]报道，肺癌患者的肺癌组织以及移植瘤中FGF4表达较周围正常组织升高。Arao等[11]发现，FGF4作为癌基因在肝细胞癌和胃癌中呈高表达。本研究显示，肺癌组织中FGF4 mRNA表达高于癌旁组织，肺癌细胞株NL9980、A549中FGF4 mRNA和蛋白表达水平也高于肺成纤维细胞株HFL1，高转移肺癌细胞株A549中FGF4 mRNA和蛋白表达水平高于低转移肺癌细胞株NL9980。表明FGF4在肺癌组织中的表达增高，且FGF4与肺癌的增殖和转移有关。FGF与存在于细胞表面的FGF受体结合[1]，将信号传递到胞内，进而激活下游信号通路，促进基质金属蛋白酶(MMP)等表达，而MMP的表达与肿瘤侵袭、转移、分期、分型、生存率有关[12]。FGF4参与多种病理生理过程，包括胚胎发育、损伤修复、肿瘤发生发展[7]。在多种肿瘤进程中，都发现了FGF/FGFR信号的异常，例如涉及肿瘤细胞的增殖、调节肿瘤细胞的黏附、移动以及新生血管的形成[13，14]。为进一步检测FGF4对肺癌细胞增殖和转移的影响，我们构建了过表达FGF4的NL9980稳定细胞株NL9980-FGF4-oe和敲除FGF4的A549稳定细胞株A549-FGF4-si进行MTT和划痕实验，结果显示，NL9980-FGF4-oe细胞的FGF4蛋白表达水平较NL9980细胞上升，A549-FGF4-si细胞株的FGF4蛋白表达水平较A549细胞下降；NL9980-FGF4-oe细胞的增殖能力高于NL9980-NC，而A549-FGF4-si细胞的增殖能力低于A549-NC细胞。划痕实验结果表明，按细胞迁移能力大小排序：NL9980-FGF4-oe细胞>A549-NC细胞>NL9980-NC细胞>A549-FGF4-si细胞，证实FGF4表达与细胞迁移能力有关。FGF4对癌细胞的生长及转移有显著正向调控作用，FGF4高表达促进肿瘤细胞的mRNA及蛋白表达，提高肿瘤细胞的增殖能力，增强肿瘤细胞的迁移能力；敲除FGF4后，肿瘤细胞在mRNA及蛋白表达、增殖及迁移能力方面均受到明显抑制。

综上所述，FGF4作为肿瘤细胞的癌基因和胚胎发育的重要细胞因子，在肿瘤细胞与癌旁细胞中的表达有着显著差异，FGF4对肿瘤的发生发展起到了正向调控作用，其信号通路紊乱可导致肿瘤的发生，FGF4过表达对肺癌细胞增殖及转移起到促进作用。研究FGF4与肺癌细胞增殖及转移的关系，将有望以其作为治疗靶点及生物标志物，对于降低肺癌患者的致死率、改善患者预后、提高患者生存质量具有良好的临床应用前景。

参考文献：

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