黄芪注射液超滤工艺优化研究

李响明，丁艳谱，孙胜斌，姜国志

(1.神威药业集团有限公司，河北　石家庄　051430；2.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北　石家庄　051430；3.河北省中药注射剂工程技术研究中心，河北　石家庄　051430)

中药注射液是以中医药理论为指导，采用现代制药工艺技术，从中药或天然药物中提取有效物质制成的无菌溶液剂，因其具有作用迅速、生物利用度高的特点，应用于急危重症、感染性疾病、心脑血管疾病和恶性肿瘤等治疗。国家药品标准中已公布的中药注射剂制备工艺多为水提醇沉、醇提水沉、蒸馏[1]。这些工艺在中药提取后，精制工艺过于粗糙，可能导致成品中残留植物蛋白、核酸、鞣质等大分子杂质[2]。有研究表明，残留的中药大分子类物质容易引发临床的过敏反应[3-4]，生产中需引入一项可去除易致敏物的技术，提高临床用药安全性。近年来超滤技术已逐步应用于中药制剂领域，尤其是用于中药注射剂，已有含丹参的中药注射液[3]、刺五加注射液[4]、生脉注射液[5]、活血通络注射液[6]等文献中应用该技术的报道。

超滤是一种现代膜分离技术，利用膜的选择透过性，对双组分或多组分的溶质和溶剂实现分离、分级、提纯和富集的过程，广泛应用于去除中药制剂大分子类物质[7]、细菌内毒素[8]和热原[9]。超滤膜分有机膜和无机膜，有机膜是比较常用的材料，包括聚砜(PS)[10]、聚醚砜(PES)[11]、聚丙烯(PP)[12]、醋酸纤维素(CA)[13]、聚砜酰胺[14]、聚偏氟乙烯[15]、混纺[16]等。

黄芪注射液是由豆科植物蒙古黄芪或膜夹黄芪的干燥根提取精制后制得的灭菌水溶液。具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿的功能，用于心气虚损、血脉瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝炎。有研究表明，其中主要起临床药效作用的为皂苷类和黄酮类物质。黄芪注射液因其疗效可靠，应用范围不断扩大，使用出现发热、过敏性休克、恶心等不良反应的报道[17-18]也日益增加。因此需优化黄芪注射液的生产工艺，提高临床用药安全。通过文献检索发现，黄芪注射液应用超滤技术最大限度地保留药效物质，同时去除细菌内毒、大分子物质的研究鲜有报道。针对这一现状，本研究应用板式聚醚砜(PES膜)引入超滤技术优化黄芪注射液的精制工艺，为超滤技术在中药注射液中的应用提供参考。

1　试药和仪器

1.1 试药

黄芪注射液药液(神威药业集团有限公司)；黄芪甲苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110781-201515、111920-201505)；细菌内毒素工作标准品(批号：150601-201681，80 EU/支，中国食品药品检定研究院)；动态浊度法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号：1701222，检测范围：10～0.03 EU·mL-1，规格1.25 mL/支)；细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号：1701190，内毒素含量<0.003 EU·mL-1)；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1260(ELSD、DAD)高效液相色谱仪(美国安捷伦)；CPA225D电子天平(Sartorius)；BET-72型细菌内毒素测定仪(天津市天大天发科技有限公司)；Millipore板框超滤器(平板式，PES膜，0.1 m2)；蠕动泵(美国密理博)；所用玻璃器材经洗液浸泡清洗干净后，250 ℃干热灭菌30 min。

2　方法

2.1 黄芪药液制备

经预实验测定，超滤前药液本身细菌内毒素水平较低，采用外加一定量细菌内毒素的方法模拟细菌内毒素突发污染时较高的水平，直观地考察超滤去除细菌内毒素的效果。取黄芪注射液批量生产过程中稀释前的浓溶液外加一定量细菌内毒素，加入适量注射用水制备成表2相应浓度的药液，即超滤前原液。

由于超滤设备有一定死体积，超滤系统中会存有少量水，因此在超滤前首先排空，用>2倍死体积的药液平衡后，超滤前药液在一定压力差下经超滤膜超滤。待样品到达最小工作体积时，补加一定量水，继续采用等体积透析法超滤，直至超滤前药液完全滤出，超滤结束后将渗透液加水定容后取样，取超滤前后的药液测定内毒素和黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。

2.2 检测方法

2.2.1 黄芪甲苷含量测定方法按照黄芪注射液国家药品标准(2001ZFBO171)测定。

色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(75∶25)为流动相；流速为1 mL·min-1；ELSD(蒸发光散射)检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取本品25 mL，蒸干，用甲醇定容至5 mL，作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液8、12、16 μL，供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，将峰面积及浓度均取常用对数后用外标法计算，求出供试品浓度的常用对数，再转换成供试品的含量即得。

2.2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法按照黄芪注射液质量标准公示草案方法测定。

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为260 nm；柱温为30 ℃，理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。

表1　毛蕊异黄酮葡萄糖苷梯度洗脱程序

对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加20%乙腈制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密吸取本品2 mL，置20 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.3 总固体测定方法精密量取药液10 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上蒸干，在105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，计算遗留残渣量。

2.2.4 细菌内毒素参照《中华人民共和国药典》2015年版通则1143第二法，采用动态浊度法测定细菌内毒素。

2.3 计算方法

含量透过率=(过滤前药液含量×过滤前药液体积)/(过滤后药液含量×过滤后药液体积)×100%

(1)

总固体降低率=[1-过滤后药液总固体×过滤后药液体积/(过滤前药液总固体×过滤前药液体积)]×100%

(2)

细菌内毒素去除率=[1-过滤后药液细菌内毒

素×过滤后药液体积/(过滤前药液细菌内毒素×过滤前药液体积)]×100%

(3)

2.4 正交试验设计

根据实际生产过程控制及文献报道，以黄芪注射液药液各含量透过率、总固体降低率及细菌内毒素去除率为考察指标，采用L9(34)正交试验设计(见表1)，对药液温度(A)、药液浓度(B)、超滤膜孔径(C)和进出口压力差(D)进行4因素3水平筛选，采用加权综合评分法计算综合得分(S综合=黄芪甲苷含量透过率×0.3+毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量透过率×0.3+总固体降低率×0.2+细菌内毒素去除率×0.2)。

表2　正交试验因素水平表

3　结果

根据表1正交试验因素水平表，得出试验结果，见表3～4。

表3　正交试验结果

表3(续)

表4　各指标项目方差分析表

注：*P<0.05为显著，**P<0.01为极其显著。

从表3正交试验结果直观分析来看，各因素对黄芪甲苷含量透过率的影响程度为A>C>D>B；对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量透过率的影响程度为C>A>D>B；对总固体去除率的影响程度为C>B>A>D；对细菌内毒素去除率的影响程度为C>A>D>B。从两个含量的透过率的极差值来看，超滤膜孔径是影响最大的因素，随着膜孔径的增大，因被膜截留而损失的含量减少。在含量透过率高，总固体降低率低，细菌内毒素去除率高的前提下，可适当提高被超滤药液的温度，降低药液的总固体，可增大药液的流动性，提高超滤速度，缩短超滤时长。采用加权综合评分法计算综合得分可知，最佳组合为A3B2C2D2，即药液温度45～60 ℃、药液浓度总固体60 mg·mL-1、超滤膜孔径10 K、进出口压力差0.07 MPa，在此条件下细菌内毒素去除率、有效成分透过率较为理想。

各指标项目的方差分析表来看，因素C超滤膜孔径对黄芪甲苷含量透过率、细菌内毒素去除率有极显著影响作用；因素A药液温度和因素C超滤膜孔径对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量透过率有显著影响作用；因素C超滤膜孔径对总固体降低率有显著影响作用。因素A药液温度、因素C超滤膜孔径、因素D进出口压力差是影响综合评价得分的极显著影响因素，这与直观分析的结果一致，说明只有选择合适的超滤膜孔径才能在有效去除细菌内毒素的同时保证药效物质较高的透过率。

4　讨论

使用传统的醇沉、水沉去除杂质的方法，可以在某种程度上满足精制目的。而仅靠这种精制工艺在中药注射液生产中除杂，易出现有关物质残留高，临床使用后易出现过敏反应。在中药注射剂生产中应用膜分离技术后，可有效去除鞣质、树脂等大分子物质和细菌内毒素，保留分子结构相对简单、分子量相对小的有效物质，保障药品的安全性、有效性。综合本研究的结果可以看出，在选择的4个因素中，适宜的超滤膜孔径可以保留黄芪注射液中以黄芪甲苷为代表的皂苷类成分和以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为代表的黄酮类成分，同时可有效去除细菌内毒素，实现了临床用药的有效性和安全性要求。

由于细菌内毒素具有脂多糖的结构，在溶液中易缔合成团聚大分子，分子量可大到几百万，选择适宜的超滤膜材质和孔径，可很好地去除细菌内毒素。这一理论与本研究数据结果一致。本研究采用常用的动态浊度法测定细菌内毒素，但因易出现假阳性结果，必须先进行方法学研究[19]。

目前尚未建立关于中药注射液应用超滤技术的研究规范或指导原则，文献中报道的也多是对超滤液中代表性成分、总固体、细菌内毒素的研究，对超滤液的药效基础评价较少[20-21]。笔者认为，除对以上项目研究外，还应进一步研究评价超滤技术后在产品基本药理作用方面的影响，物质基础结合药效学，从而整体、全面地科学评价超滤技术应用于生产的可行性。

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