基于网络药理学的四逆汤抗心肌缺血损伤的分子机制研究△

张欢欢，刘寒，向净匀，吴杰，高原雪，何林，李敏，王斌

(陕西中医药大学，陕西　咸阳　712046)

缺血性心脏病(Ischemic heart disease，IHD)是目前威胁人类生命健康的主要原因之一[1]。急性冠状动脉闭塞所致的急性心肌梗死是缺血性心脏病中非常严重的一类疾病，立即恢复中断的血液供应是挽救濒临死亡心肌的关键所在。然而，心肌持续一段时间缺血后重新恢复血流灌注会导致心肌结构和功能的损伤加重，即产生缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion，I/R)。I/R能导致心肌细胞缺血损伤、血管功能异常和心力衰竭，甚至可导致猝死。研究发现，I/R加重心肌损伤可能与细胞内钙超载、氧自由基释放、心肌能量代谢障碍、中性粒细胞浸润、血管内皮细胞损伤和细胞凋亡等有关，但具体机制尚未完全阐明[1-2]。

四逆汤是《伤寒论》的经典要方，主要由淡附片、干姜、炙甘草以3∶2∶3比例组成。具有温中驱寒、回阳救逆之功效，用于阳虚欲绝、冷汗、四肢厥逆、下利清谷、脉微欲绝等症。现代临床疗效观察和动物实验研究均表明，四逆汤在心脑血管疾病的预防和临床治疗中疗效显著，尤其对心肌缺血损伤疗效确切[3]。虽然目前对四逆汤药理作用研究报道较多，但作用机制和配伍规律研究不够系统和全面，本实验运用网络药理学对四逆汤抗心肌缺血作用机制和配伍规律进行预测分析，以期为中药复方作用机制和配伍规律研究提供参考。

1　研究方法

1.1 四逆汤中候选活性化合物的收集与筛选

在传统中药数据库TCMSP[4](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中收录四逆汤相关的活性化合物的基础上，笔者结合TCMID(http：//www.megabionet.org/tcmid/)及TCM-PTD(http：//tcm.zju.edu.cn/)等数据库收集四逆汤中的主要化学成分，通过文献挖掘并利用TCMSP和Pub Chem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)等平台对每一个活性化合物的分子结构进行确证，最后将化合物统一保存为mol2格式或sdf格式文件。利用TCMSP数据平台，对主要化合物成分的药物动力学(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME)性质进行评估，选取同时满足口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥40%和类药性(Drug-Likeness，DL)≥0.18的化学成分作为候选活性成分。其中OB与生物利用度直接关联；DL是指待测分子与药物分子的相似度，即成为药物的可能性。

1.2 潜在靶点的预测

对接得分(Z-score)代表活性成分与蛋白质的相互作用强度。DRAR-CPI服务器(https：//cpi.bio-x.cn/drar/)采用双向Z-变换函数转换成Z分数从而提高预测准确性，服务器建议选取药物分子与蛋白质相互作用(chemical-protein)的Z-score<-0.5纳入为潜在靶点。因此，登陆服务器上传筛选得到的四逆汤候选活性分子的mol2格式或sdf格式文件。下载计算结果，为进一步缩小范围和提高预测准确度，蛋白靶点纳入标准设为Z-score<-1。将筛选得到的蛋白靶点的PDBID导入UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/)，经过检索和转化操作得到四逆汤成分的基因靶点。

1.3 心肌缺血疾病相关靶点的收集

从DisGeNET(http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)和CTD(http：//ctd.mdibl.org/)数据库中收集抗心肌缺血损伤药物作用靶点，并结合文献挖掘的方法建立心肌缺血损伤疾病相关靶点数据库。

1.4 活性成分-抗心肌缺血损伤靶点的筛选

将上述收录的四逆汤共同作用靶点与心肌缺血疾病相关靶点进行比对分析，归纳总结出具有明确抗心肌缺血作用的预测靶点，最终建立四逆汤抗心肌缺血损伤作用靶点基因库。

1.5 蛋白与基因信息校正

由于检索到的靶点可能存在命名不规范或包含来源于不同物种的蛋白或基因，因此，上述每一步靶点的收集后都需要对靶点信息进行规范化处理。具体方法如下：采用 UniProt数据库中UniProtKB搜索功能，输入蛋白名称(protein name)并限定物种为人(Homo sapiens)，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称(Official Symbol)并摘录标准基因名，经过数据库检索和转化操作，获取正确的靶点信息。

1.6 基因分析与通路注释

本实验应用MAS 3.0(http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)生物分子功能注释系统对四逆汤抗心肌缺血损伤的共同作用靶点进行基因功能分析和KEGG通路注释，将四逆汤调控靶蛋白对应的基因直接映射到通路上，药物靶点富集出的通路被认为是药物调控的通路，参数设置见表1。

表1　基因富集分析参数设置

1.7 网络构建与分析

将四逆汤中筛选出的共同作用靶点(基因)与富集得到的通路作为网络的节点(node)，在Excel表格中建立相互对应关系作为网络的连接(edge)，导入Cytoscape 3.3.0软件构建网络图，network analyzer插件进行网络度(degree)、介数(betweenness)等网络互作分析。从四逆汤-靶点-通路网络图(Compound-Target-Pathway网络图)分析四逆汤抗心肌缺血的共同作用靶点，并明确药物与通路之间的协同作用或叠加作用。

2　结果

2.1 四逆汤活性成分筛选结果

从TCMSP数据库中建立四逆汤口服易吸收的化合物库，分别以附子、干姜、甘草为检索词，在数据库中分别检索到64、148、280个小分子化合物，去除重复的小分子化合物，然后依据OB≥40%，DL≥0.18为筛选标准对化合物进行二次筛选，将数据库中具有较高活性的化合物筛选出来，分别得到11、2、70共83个化合物。

化合物的补充：考虑到化合物含量、代谢及药理作用对四逆汤有效化合物进行补充。淡附片为四逆汤的君药，其主要成分为生物碱类，所以在选取化合物中再加入deoxyaconitine、Aconitine、hypaconitine、Mesaconitine[5]到筛选得到的11个化合物中。干姜为四逆汤的臣药，主要含有挥发油类成分及姜辣素成分，因此加入zingiberol、zingiberene、(10)-Gingerol[6]、(8)-Gingerol、4-Gingerol、[5]-gingerol、12-姜酚[6](12-Gingerol)、6-姜酚[7](6-gingerol)。而甘草为四逆汤的佐药，其主要成分为甘草酸、甘草苷等，因此加入Glycyram、glabrolide、isoglabrolide、neoisoliquiritin、18β-glycyrrhetinic acid和β-Glycyrrhetinic acid。

基于以上分析研究，附子加入4个相关化合物，干姜加入8个化合物，甘草加入6个化合物，共计获得101个小分子化合物，其中附子及甘草中各有1个化合物没有预测到相关靶点，故仅总结保留的99个化合物信息。结果见表2。

2.2 四逆汤抗心肌缺血相关靶点信息

将从TCMSP、TCMID及TCM-PTD并结合文献挖掘方法收集到的基因整理，删除重复项，共得313个相关靶点；采用DisGeNET和CTD数据库并结合文献挖掘方法搜寻与心肌缺血相关作用靶点共818个，建立心肌缺血损伤疾病靶点库；将收集到的四逆汤基因与疾病靶点比对分析，归纳总结出预测靶点中有明确抗心肌缺血损伤作用的靶点91个，91个靶点信息见表3。

表2　四逆汤组成成分的化学信息和网络参数

表2(续)

表2(续)

注：Caco-2是一种药物离体口服特性筛选细胞模型，了解和评价药物吸收机制；BBB是了解和评估活性成分进入中枢神经系统能力的指标。

表3　四逆汤抗心肌缺血相关靶点信息

表3(续)

2.3 四逆汤抗心肌缺血相关靶点基因分析与通路注释

将预测出的91个作用靶点通过MAS 3.0生物分子功能注释系统对获取靶点信息进行GO基因富集分析和 KEGG 靶点通路注释分析。GO基因富集分析是跨越原核以及真核等多个物种的基因功能分类体系，它分别在生物学过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组件(cellular component)3个细胞生物学领域对预测靶点的基因及其产物进行功能定义分析。四逆汤抗心肌缺血的91个潜在作用靶点的GO分析结果发现见图1，在生物学过程分析中，蛋白水解(21个靶点)、信号转导(18个靶点)、氧化还原(16个靶点)、炎症反应及脂代谢(9个靶点)排列靠前，其同时还与血压调节、抗凋亡等生物学过程有关；在分子功能分析中，蛋白结合(39个靶点)、金属离子结合(23个靶点)、肽酶活性(21个靶点)、锌离子结合(21个靶点)、氧化还原酶活性(16个靶点)、转移酶活性(15个靶点)及钙离子结合(13个靶点)排列靠前，其同时还与丝氨酸型内肽酶活性、细胞因子活性、NADP结合及受体活性有关；细胞组件成分分析发现细胞质(47个靶点)所占比例最大。通过以上分析，反映心肌缺血涉及体内多个生物过程且与多种蛋白结合、酶活性等有关，同时表明四逆汤通过改善这些生物过程发挥其抗心肌缺血作用。

注：A.生物过程；B.分子功能；C.细胞组分。图1　预测靶点的GO富集分析生物过程、分子功能和细胞组分

通过KEGG基因注释功能分析91个相关靶点富集映射出122条信号通路(见图2)，23条直接或间接与心肌缺血有关，其中与炎症反应相关的有9条，分别是Cytokine-cytokine receptor interaction、Toll-like receptor、MAPK、TGF-beta、Jak-STAT、Arachidonic acid metabolism、Focal adhesion、Fc epsilon RI、Cell adhesion molecules(CAMs)信号通路；与细胞凋亡相关的信号通路有8条，分别是VEGF、Apoptosis、Gap junction、ErbB、Fc epsilon RI、p53、Glutathione metabolism、Regulation of autophagy信号通路；与心脏功能相关的信号通路有4条，分别是Calcium、Fc epsilon RI、Renin-angiotensin system、Regulation of actin cytoskeleton信号通路；与血管和血小板聚集有关的信号通路有7条，分别是Complement and coagulation cascades、Jak-STAT、Renin-angiotensin system、Fc epsilon RI、Arachidonic acid metabolism、Complement and coagulation cascades、Cell adhesion molecules(CAMs)信号通路。其中9个靶点参与补体系统信号通路的调节，7个靶点参与调节细胞因子-细胞因子受体相互作用和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，四逆汤主要活性成分的作用靶点分布于不同的代谢通路，相互协调、共同调节是其抗心肌缺血的可能作用机制。

2.4 四逆汤-靶点-通路网络构建与互作分析

利用Cytoscape 3.3.0软件，建立“四逆汤药物-分子-靶点-信号通路”图(见图3)，直观展现四逆汤41个共同作用靶点与23条作用通路与心肌缺血疾病之间的关系。分析结果表明，补体系统、细胞因子及MAPK信号通路排位靠前，是网络中的枢纽节点，其还可以通过Toll-like receptor、VEGF、TGF-β等信号通路发挥作用。另外Toll-like receptor和Apoptosis信号通路节点相对靠前，提示四逆汤可能通过调节补体系统、炎症、细胞凋亡、心血管功能等通路发挥协同作用。

通过网络分析计算具体节点的拓扑学特征，能够帮助我们从复杂的网络关系中获得潜在的生物学信息。在生成的网络中，节点代表药效分子、靶标、通路，边代表药效分子-靶标-通路间的相互作用。为了说明节点的重要性以及节点如何影响两个节点之间的信息交流，我们计算了网络的两个关键拓扑参数：网络度(degree)和介数(betweenness)，见表4～6。

图2　预测靶点的KEGG富集通路分析

注：●中药干姜、附子和甘草；▲中药活性化合物；活性化合物作用的相关靶点；■活性化合物富集得到的通路图3　四逆汤药物-分子-靶点-信号通路图

表4　药物-分子-靶点-信号通路网络图中主要活性化合物拓扑学参数

表4(续)

注：表中选取网络度大于平均值6.63的化合物。

表5　药物-分子-靶点-信号通路网络图中关键靶点拓扑学参数

注：表中选取网络度大于平均值14.41的靶点。

表6　药物-分子-靶点-信号通路网络图中主要通路拓扑学参数

注：表中选取网络度大于平均值3.65的信号通路。

从图3以及表4～6可以清楚看出四逆汤中3味中药中重要化合物、靶点和信号通路情况，可以全面了解四逆汤中药物活性成分发挥作用的主要机制。从表4看出附子中有9个化合物的degree值高于平均水平，干姜中的6-姜辣素、8-姜辣素5-姜辣素及12姜辣素的degree值均低于平均水平，仅有MOL002514_ Sexangularetin的degree值高于平均水平，而甘草中有22个化合物的degree值高于平均水平，且18β-glycyrrhetinic acid、glabrolide、Mairin位居前三。从表6看出，Complement、coagulation cascades、MAPK signaling pathway和Cytokine-cytokine receptor interaction位列前三，分别富集靶点9、7和7个，包括F10、SERPINE1、F13A1、SERPINA1、F9、PLG、F7、F2、PLAU、IL10、CX3CL1、HGF、IL6、IL4、AMH、TNFRSF1A、MAPK1、NTRK2、CASP3、AKT1、SOS1、PLA2G2A、TNFRSF1A共23个靶点，说明3味中药更可能通过这3条信号通路发挥抗心肌缺血作用。

3　讨论

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。研究表明，药物与靶点之间倾向于组成富集的网络，而不是孤立的一一对应关系，大多数药物通过多靶点发挥作用，而中药作为一个系统，被认为是多靶点体系，但这种多靶点技术是建立在系统的思想和哲学方法上，其与系统生物学的哲学思想有一定的相似之处。临床上的多种慢性病如肿瘤、心脑血管疾病等都是多基因、多因素作用的疾病，仅根据单一作用靶点难以达到良好治疗的效果。而TCMSP是一个包含31 000多个化合物的中药分子数据库，其采用系统药理学技术来研究复杂的中药体系，为中药研究提供了新的思路和方法[8]。

文献报道，四逆汤中的淡附片的主要成分为生物碱类、黄酮类、皂苷类等，已发现并鉴别的化学成分有122种，其中乌头生物碱成分有105种，主要包括双酯型、单酯型和醇胺型二萜类生物碱，这些生物碱对心血管系统的疾病疗效显著。干姜主要含有挥发油类成分及姜辣素成分，而炙甘草主要成分为三萜皂苷类、黄酮类化合物，其中甘草酸及其水解产物甘草次酸均为三萜皂苷类成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等疗效。

近年来，大量的动物实验和临床应用研究发现四逆汤在冠心病、心绞痛等方面具有良好的治疗效果，这主要与四逆汤可以保护心肌、降低血压、保护血管和免疫调节等作用有关[9-10]。四逆汤为配伍减毒方剂的代表，附子由于含有乌头碱、新乌头碱等而有剧毒，因此入方时需对其进行减毒处理。四逆汤中选用炙甘草和干姜对其进行配伍，使其毒性大大降低，并发挥了显著疗效。附子-甘草是配伍减毒的代表药对，对其减毒机制研究主要集中在以下几点：1)酸碱共沉淀。附子中的乌头类生物碱与甘草中的甘草酸等酸性皂苷类成分，在共同煎煮后发生沉淀反应，生成不溶于水的大分子络合物，降低药物毒性；2)甘草影响毒性成分在胃肠道的吸收过程。由于甘草具有诱导细胞色素P450的作用，加速了附子中生物碱成分的代谢而缓和了药物毒性；3)甘草拮抗乌头类生物碱毒性作用。甘草酸的水解产物葡萄糖醛酸可与乌头类生物碱的羟基形成低毒或无毒的葡萄糖醛酸络合物，经尿液排出体外，发挥减毒作用。其还可通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路降低药物毒性[11-12]。附子-干姜配伍，除了具有类似甘草的解毒作用外，还能够通过诱导P-糖蛋白(P-gp)，从而抑制附子中双酯型生物碱的吸收[11-13]。

四逆汤中的甘草和生姜不仅具有减毒作用，还具有协同增效作用。甘草对附子的增效作用主要表现在两者各成分之间的协同作用。甘草与附子合用其强心作用增强，同时也具有对抗心律失常作用，这些作用与甘草中的甘草酸密不可分，但其协同的具体机理还需进一步探究。干姜对附子的增效作用主要是干姜与附子有相似的强心作用，同时干姜的主要活性成分姜酚能够抑制细胞色素氧化酶P450(CYP450)含量及亚型 CYP2E1、CYP3A活性，能使附子中的有效成分代谢减少，从而发挥增效作用[11-14]。

综合以上分析，四逆汤在体内发挥作用是药物拮抗减毒和协同增效的结果，本实验应用网络药理学方法对附子、干姜和甘草的共同作用靶点进行预测，结果显示，补体系统[15-16]、细胞因子[17-18]及MAPK[19-20]信号通路是重要的中枢纽节点。补体系统是天然免疫的重要组成部分，参与抗感染与免疫调节，其激活后，补体蛋白经过一系列酶促反应生成攻膜复合物(MAC、C5b-9)、C3a和C5a等补体成分，通过MAC的直接损伤及中性粒细胞的间接损伤作用，引起细胞损伤。细胞因子能够参与和调节免疫应答，并能够诱导炎症反应。MAPK通路参与细胞生长、增殖和凋亡等生理过程，并影响神经突触可塑性。本次研究网络分析及靶点代谢通路富集分析结果显示：9个靶点参与补体系统信号通路的调节，7个靶点参与调节细胞因子-细胞因子受体相互作用和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，表明四逆汤可能通过补体系统、细胞因子及MAPK信号通路发挥抗心肌缺血作用。

综上所述，四逆汤发挥抗心肌缺血的方式主要有调控补体系统、细胞因子及MAPK信号通路，也可以通过Toll-like receptor、VEGF、TGF-β等信号通路发挥作用。预测所得的活性成分、抗心肌缺血靶点揭示了四逆汤多成分、多靶点的协同抗心肌缺血的作用特点。同时本文采用的虚拟方法可应用于类似中药及复方的筛选研究；筛选出可能有效的成分，为后期植物药的分离纯化、结构修饰和化学合成提供依据；筛选出抗心肌缺血的靶点、通路，为心肌缺血病的新药研究和临床治疗提供参考。

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