基于HPLC指纹图谱及多元功效成分定量分析的南五味子药材质量标准提升研究△

马新飞，郭盛，朱邵晴，朱振华，曹雅琦，王雪华，段金廒

(南京中医药大学　江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏　南京　210023)

南五味子(Schisandrae Sphenantherae Fructus)为木兰科多年生藤本植物华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，主要用于久嗽虚喘、遗梦滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、内热消渴及心悸失眠等症的治疗[1]。现代研究表明，南五味子中含有木脂素类、黄酮类、有机酸类、核苷类、氨基酸等多种类型化学成分[2-4]，其中木脂素类成分具有调节中枢神经系统功能、降低谷丙转氨酶、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多重药理作用，目前认为是南五味子传统功效发挥的主要效应成分之一[5]。有关南五味子药材质量标准，《中华人民共和国药典》2015年版仅以五味子酯甲作为质量控制指标[1]，这种传统的单一指标质量控制模式，难以反映药材的真实质量。HPLC指纹图谱因其蕴含各色谱峰的出峰顺序、保留时间、峰高、峰面积等综合信息，已成为中药整体性化学特征表征的有效方法，具有较好的专属性和适用性[6-7]。本研究在参考相关文献的基础上，采用HPLC对不同产地12批次南五味子药材进行研究，初步建立了南五味子药材的HPLC指纹图谱，并在此基础上建立同时测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素含量的HPLC方法，以期为南五味子药材质量标准的提升提供参考。

1　仪器与试剂

1.1 仪器

Waters2695Alliance高效液相色谱系统、Waters2998PDA 检测器、EmpowerTM 色谱工作站软件(Waters公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Microfuge16 型台式微量离心机(美国BeckmanCoulter公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与样品

乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，甲酸(色谱纯，德国Merck公司)，去离子水为经Millipore超纯水制备系统自制；其他化学试剂均为分析纯。对照品五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素(四川省维克奇生物科技有限公司)，经HPLC分析，纯度≥98%。12批南五味子药材收集于陕西、湖北、河南、山西，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实，样品信息见表1。

表1　南五味子药材样品信息

2　方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为AlltimaTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；进样体积：10 μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸水，按表2所示梯度程序洗脱；检测波长：254 nm。对照品色谱图见图1。

表2　南五味子中7个木脂素类成分含量测定的流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成分别含五味子甲素0.101 1 mg·mL-1、五味子酯甲0.109 3 mg·mL-1、五味子酯乙0.106 4 mg·mL-1、五味子醇甲0.101 9 mg·mL-1、五味子醇乙0.104 5 mg·mL-1、安五脂素0.108 1 mg·mL-1、五味子酚0.104 2 mg·mL-1的混合对照品溶液。

注：1.五味子醇甲；2.五味子醇乙；3.五味子酯甲；4.五味子酯乙；5.五味子酚；6.安五脂素；7.五味子甲素。图1　木脂素类混合对照品溶液HPLC图

2.2.2 供试品溶液的制备取南五味子药材适量，粉碎，过三号筛，取粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理20 min(250 W，40 kHz)，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 HPLC指纹图谱研究

2.3.1 精密度试验精密吸取同一供试品(S01)溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色图谱，以20号峰(五味子酚)为参照峰，计算6次进样的各共有峰的相对保留时间的RSD<0.5%，相对峰面积的RSD<2.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验取同一供试品(CD1)药材粉末6份，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图，以20号峰(五味子酚)为参照峰，计算6份样品各共有峰相对保留时间的RSD<0.6%，相对峰面积的RSD<2.5%，表明该实验方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取同一供试品(S01)溶液，室温储藏，按2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录色谱图，以20号峰(五味子酚)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD<1.0%，相对峰面积的RSD<2.5%，表明供试品溶液在24 h内测定稳定。

2.3.4 指纹图谱共有模式的建立取不同来源的南五味子药材粉末1.0 g，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录75 min色谱图，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”进行数据分析处理，剪切5 min前的溶剂峰以及66 min后的杂质峰，以S1为参照图谱，设定时间漂移值0.2，采用中位数法谱峰自动匹配，生成南五味子药材指纹图谱共有模式(即对照图谱，见图2)。将该对照图谱(R)的相似度值定为1，计算12批次不同产地南五味子药材样品指纹图谱的相似度，结果显示其相似度均大于0.93(见表3)，说明相似度良好，见图3。

注：10.五味子醇甲；11.五味子醇乙；17.五味子酯甲；18.五味子酯乙；20.五味子酚；22.安五脂素；24.五味子甲素。图2　南五味子药材指纹图谱共有模式

图3　不同产地南五味子药材指纹图谱

表3　12批不同产地南五味子药材指纹图谱相似度计算结果

注：*图谱序号同表1样品编号。

2.3.5 共有指纹峰的标定以12批南五味子药材指纹图谱与生成的对照图谱进行色谱峰匹配，以匹配数目达12者作为共有峰，结合对照品图谱进行指纹峰的标定(见图1)；以20号峰(五味子酚)为参照峰，计算共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果显示：12批南五味子药材共有峰数目为28，经计算，所有共有峰面积之和占总峰面积的80%以上；12批样品色谱共有指纹峰相对保留时间的RSD值均小于1.2%，相对峰面积的RSD值差异较大，表明样品之间各共有峰组成差异显著。

经与对照品紫外光谱及保留时间比对，鉴定出峰10、11、17、18、20、22、24分别为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素。

2.4　7个木脂素类成分的测定

2.4.1 线性关系考察取对照品加甲醇配制并稀释成系列不同浓度混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样10 μL，记录各化合物峰面积。以各对照品质量浓度(mg·mL-1)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性回归方程，见表4。

表4　南五味子中7个木脂素类成分线性关系考察结果

2.4.2 精密度试验取同一混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录各化合物峰面积，考察仪器精密度，结果见表5。各化合物峰面积RSD值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验取同一批次(S01)药材粉末6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录各化合物峰面积，计算6份样品中7个成分含量的RSD值。结果见表5。各待测成分含量的RSD值均小于2.7%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验取2.4.3项下制备的供试品溶液1份，室温储藏，按2.1项下色谱条件分别于0、1、2、4、8、16、24 h进样测定，记录峰面积，计算峰面积的RSD值，考察供试品溶液的稳定性，结果见表5，化合物峰面积的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.4.5 加样回收试验取2.4.3项下已知含量的样品(S01)粉末9份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入对照品适量(加入量分别为基础值的80%、100%、120%)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，计算各待测成分含量，计算加样回收率，结果见表5。

表5　木脂素类成分的精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验结果　%

2.4.6 样品测定取不同产地南五味子药材样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标一点法计算样品中各待测成分的含量，结果见表6。南五味子药材样品中，以五味子甲素含量最高，平均质量分数可达7.889 mg·g-1，安五脂素、五味子酯甲含量其次，平均质量分数分别为5.128、4.944 mg·g-1，五味子醇甲、五味子醇乙含量相对较低；7个木脂素类成分平均总质量分数达22.09 mg·g-1；不同产地样品间木脂素类成分差异较大，其中五味子醇甲含量差异最大，RSD值达86.41%；不同产地南五味子药材中，河南洛阳所产南五味子药材含木脂素类成分总量最高，陕西商洛平均总量显著低较低，山西运城所产者最低。

3　讨论

本研究在建立南五味子药材指纹图谱过程中，分别考察了样品提取溶剂、流动相等对色谱峰行为的影响，结果显示以甲醇作为提取溶剂，目标组分提取较为充分。因20号峰(五味子酚)峰面积较大，分离度较好、含量较高、对照品容易获得，且色谱峰位于色谱图中间位置，故以其作为参照峰。

表6　不同产地南五味子药材中木脂素类成分的含量测定结果　mg·g-1

注：—表示未检测到。

含量测定项分别选择目前报道的与南五味子发挥传统功效密切相关的7个木脂素类成分作为指标性成分，可较为全面地反映南五味子药材的内在质量[5]。含量测定结果显示不同产地南五味子药材中7个木脂素类成分含量的RSD值均大于20%，含量差异较大，提示在生产过程中应作为重点指标加以控制。

本研究所建立的南五味子药材指纹图谱相似度大于0.93，所建立的同时测定7个指标的含量测定方法灵敏度高、专属性强，二者结合可有效杜绝为达到某一质量标准而人为添加某一成分的现象，为南五味子药材质量标准的提升提供了支撑。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：244.

[2]杨文潮，杨洁，段金廒，等.南五味子中氨基酸类成分分析评价[J].中药材，2016，39(2)：342-347.

[3]杨洁，段金廒，李国龙，等.南五味子中核苷类成分分析评价[J].药物分析杂志，2015，35(6)：966-973.

[4]杨洁，段金廒，李国龙，等.不同产地南五味子中木脂素分析研究[J].中国中药杂志，2014，39(23)：4647-4652.

[5]胡竟一，白筱璐，雷玲，等.南五味子总木脂素的催眠作用及对脑单胺类神经递质的影响[J].中药药理与临床，2016，32(2)：110-113.

[6]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44(22)：3095-3104.

[7]王领弟，臧亚茹，潘伟东，等.基于指纹图谱结合多元统计分析评价山楂叶质量差异性[J].中国现代中药，2017，19(12)：1692-1696.