阿霉素载药微球在免疫缺陷大鼠肝脏原位肿瘤组织内缓释作用与长效抗肿瘤活性研究

武瑾，赵鹏，姜棋予，马燕，张木子荷，李树，王威，郭妤姝

1.解放军总医院 第六医学中心药剂科，北京100048；2.内蒙古军区卫生防疫队，内蒙古 呼和浩特010051；3.解放军总医院 第五医学中心临床研究管理中心，北京100039；4.解放军总医院第一医学中心消化内科，北京100853；5.解放军总医院 第五医学中心药学部，北京100039

我国肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率占全球一半以上，有效治疗HCC 是目前临床诊疗面临的巨大挑战[1]。HCC 存在对传统细胞毒性化疗药物系统性化疗（口服或静脉滴注）多药耐药特性（multidrug resistance，MDR），这极大地限制了HCC 抗肿瘤药物的治疗效果。同时，HCC 的治疗仍以口服分子靶向药物为主，这样的给药途径造成药物在患者的全身分布，一方面HCC 病变部位有效浓度有限，另一方面也会带来对身体各脏器的毒副作用[2]。对HCC 的精准给药和局部缓释将可避免上述问题。随着影像学技术的发展，CT 引导下经皮穿刺给药或B 超引导下TACE 治疗（transcatheter arterial chemoemboliza⁃tion）能够实现药物的精准给药，载药微球的精准给药更可实现局部缓释，为HCC 的治疗提供了新的思路[3-4]。

载药微球剂型具有诸多优点，能够实现化疗药物的靶向、缓释作用，提高药物的稳定性[5]，同时该剂型的栓塞特性可配合TACE 精准治疗，是目前抗肿瘤治疗策略的研究热点之一，值得深入研究[6]。然而载药微球实验研究的动物模型仍存在不足，主要体现在：载药微球的肌肉注射与皮下注射与肝脏的清除代谢不符，不能正确反映药物作用及清除率；小鼠肝脏体积小，不能实现肝脏原位肿瘤内给药；大型动物价格昂贵，且较难建立HCC 模型。因此，建立能够实施肿瘤精准给药的大鼠肝脏原位肿瘤模型显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料

免疫缺陷裸鼠3 只（BALB/c Nude）与免疫缺陷大鼠12 只（Nude Rats）购自北京维通利华实验动物技术有限公司；MHCC-97H 细胞由解放军总医院第五医学中心冯帆博士惠赐；载药微球及阿霉素均为苏州恒瑞迦俐生生物医药科技有限公司产品；索拉非尼（sorafenib）为Selleck 公司产品；胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培养基等细胞培养试剂购自Hyclone 公司；其余试剂均为国产分析纯试剂；细胞培养瓶、培养皿等购自Corning 公司；PET/CT 小动物活体成像系统、盖革计数器、小动物B 超由解放军总医院第六医学中心提供；小动物吸入麻醉机及手术器械由本实验室提供。

1.2 细胞培养

人高侵袭肝癌细胞系MHCC-97H 用含10%FBS 的DMEM 培养基，在5% CO2培养箱中孵育。

1.3 免疫缺陷小鼠皮下成瘤实验

用PBS 重悬MHCC-97H 细胞，接种于免疫缺陷小鼠两侧腋下及两侧腹股沟，经过2 周生长后收集皮下肿瘤组织进行后续实验。

1.4 免疫缺陷大鼠肝脏原位成瘤实验

剥取小鼠皮下肿瘤表面性状较好的部分，制备成组织微块（1 mm3），接种至大鼠肝脏原位，经过2 周生长后超声波检测肝脏肿瘤生长情况，待大鼠肝脏形成明确肿瘤病灶后进行后续实验。

1.5 免疫缺陷大鼠肝脏肿瘤原位给药

按厂商说明书制备阿霉素载药微球，将载药微球与10 mg/mL 阿霉素按1∶5 的比例混合，室温下振荡2 h，直至溶液变为相对浅色，此时的载药量约为50 mg/mL，在已成瘤动物模型的肝脏肿瘤部位开腹给药，在肿瘤组织内注射药物，每组3只。对照组给予50 mg/mL 阿霉素溶液。阿霉素与索拉非尼联用组：开腹注射阿霉素后连续3 d给予3 mg/kg 索拉非尼口服灌胃给药治疗。溶剂组给予注射用水。

1.6 阿霉素微球在组织内的清除检测

在系列时间点尾部采血收集大鼠血液标本，按照文献方法[7-8]采用液-质联用技术测定血液中的阿霉素浓度，绘制阿霉素的体内清除曲线。

1.7 肝脏原位肿瘤生长状态检测

给药1～2 周后，对大鼠进行PET/CT 小动物活体成像。动物吸入麻醉，每只动物经尾静脉注射200 μCi18F-FDG 核素探针，40～50 min 后行PET/CT 检测[9]，用盖戈计数器进行量化分析；最后解剖收集动物肝脏拍照。

1.8 统计学分析

单因素方差分析比较x±s，使用SPSS 24.0 软件，并计算P值。

2 结果

2.1 阿霉素载药微球制备及缓释特性检测

如图1A、B 所示，载药微球经涂片后在镜下呈白色微球状，与阿霉素注射液孵育后呈红色微球状。图1C 为阿霉素载药微球的体内释放情况。在大鼠肝脏原位肿瘤组织内注射阿霉素溶液或阿霉素载药微球后，阿霉素溶液注射组动物血药浓度在24 h 左右即达顶峰，血药浓度水平最高为246 ng/mL，72 h 左右即清除完毕，阿霉素的血药浓度低于检测下限；而阿霉素载药微球组的血药浓度水平最高仅为57 ng/mL，注射后9 d 仍能检测到阿霉素的分布。这表明，在大鼠原位肝脏肿瘤模中注射阿霉素载药微球能够实现阿霉素在肿瘤组织内的缓释作用，大鼠肝脏肿瘤模型能够模拟在肝脏脏器内的HCC 病灶，实现药物在肿瘤组织内的精准给药研究。

2.2 单次给予阿霉素载药微球即可抑制大鼠肝脏原位肿瘤的生长

如图2A，PET/CT 活体成像的结果与肿瘤组织照片均显示在大鼠肝脏肿瘤内原位单次注射阿霉素载药微球即可抑制HCC 细胞在大鼠肝脏原位的生长，而单次注射阿霉素溶液则不具有抗肿瘤作用。PET/CT 活体成像与肿瘤组织照片还表明，与单独注射阿霉素载药微球相比，口服灌胃给予索拉非尼联合肿瘤组织内注射阿霉素载药微球对大鼠肝脏原位HCC 肿瘤组织的抑制作用更为明显（图2B）。PET/CT 信号强度数值为肝脏信号与血液信号比值，计算抑制率（图2C）。这表明，单次给予阿霉素载药微球即可抑制大鼠肝脏原位肿瘤的生长，单次给予阿霉素载药微球并给予大鼠口服灌胃分子靶向药物索拉非尼能够实现更好的抗肿瘤效果，模拟不同药物治疗策略的联合作用。

图1 阿霉素载药微球与体内清除曲线

3 讨论

本研究在免疫缺陷小鼠皮下肿瘤模型的基础上建立了免疫缺陷大鼠的肝脏原位肿瘤模型，利用市售的载药微球制备阿霉素载药微球（江苏恒瑞公司的产品已在临床诊疗中得到广泛应用），实现了阿霉素载药微球在肿瘤组织内的精准给药。在大鼠肝脏肿瘤组织内注射药物后进行检测，确定了单次给予阿霉素载药微球既能够实现阿霉素在肿瘤组织内部的长期存留及长效抗肿瘤作用，与索拉非尼联用时更可有效抑制肿瘤的生长，模拟临床诊疗中不同药物治疗策略的联合使用。该动物模型的建立，将为精准给药相关研究及代谢性质研究等提供诸多便捷：①与小鼠相比，大鼠的肝脏较大，便于以开腹或微创方式对肝脏进行精准注射，或在B 超引导下对肝脏原位瘤块进行精准给药，且在给药剂量上将会有更多的选择；②大鼠血液总量较大，可增加时间点，多次尾部采血，进行药物代谢性质的检测；③不同于肺癌等动物模型，位于肝脏的HCC 对葡萄糖的摄取明显高于其他组织，可使用小动物PET进行检测，通过PET 信号强度反应HCC 的活性及大小。总之，大鼠肝脏原位肿瘤模型解决了目前精准给药及缓释特性研究缺少动物模型的短板，是相关研究的理想的动物模型。

图2 阿霉素载药微球抑制大鼠肝脏原位肿瘤生长

阿霉素是广谱抗肿瘤药，临床主要作为化疗药静脉推注，然而随着精准医疗的发展，为降低现有化疗药及分子靶向药的不良反应，利用新型制剂技术制成的阿霉素载药微球体现了新剂型抗肿瘤药物的发展方向[10]。为延缓及降低肿瘤细胞多药耐药的发生，提高化疗药物和分子靶向药物的疗效，本实验联用阿霉素微球与索拉非尼对HCC 进行精准给药，实验结果显示上述药物联用可更有效抑制肿瘤生长。

目前临床上已有射频消融治疗（radio fre⁃quency ablation，RFA）与载药微球联用的治疗策略，大鼠肝脏原位肿瘤动物模型能够为该治疗策略提供更好的实验数据支撑及治疗方式的改进，同样该动物模型也可模拟其他手术类型如开腹手术、腔镜引导下手术等。综上所述，本研究建立了大鼠原位肝脏肿瘤的动物模型，验证了其生物学活性，为相关研究奠定了基础，突破了肿瘤精准治疗缺少动物模型的壁垒，具有实用且广阔的应用前景。