肾透明细胞癌中长链非编码RNA SNHG12的生物信息学分析

张晓彤，周亚男，朱玉翠，胡成进，曹源

1.潍坊医学院 医学检验学系，山东 潍坊261053，2.济南市第三人民医院 检验科，山东 济南250132；3.济南军区总医院 实验诊断科，山东 济南250031

肾癌是常见癌症之一，其中肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占70%～80%，是最具代表性的亚型，发病率逐年上升[1-2]。较其他癌症而言，肾癌相关生物标志物较少，早期诊断困难，且肾癌患者对常规化疗和放射治疗反应差，缺乏靶向治疗药物，导致晚期患者（Ⅳ期）的五年生存率较低[3]。因此，寻找诊断及伴随诊断相关生物学标志物、探索发病机制以及找到新的治疗靶点至关重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为新的潜在生物学标志物和癌症治疗靶点成为研究热点。lncRNA是一类长度大于200 个碱基且无蛋白质编码能力的转录物，参与基因表达的多级调节，其异常表达和突变与肿瘤发生、转移密切相关[4-7]。此外，lncRNA 能在癌症中特异表达，并稳定存在于循环体液中[8-10]，可作为癌症的新型生物学标志物和治疗靶标，具有很强的应用前景。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因，作为一种新的lncRNA，被证实在肺腺癌、结直肠癌、乳腺癌、人骨肉瘤细胞、鼻咽癌细胞、人子宫内膜癌等多种癌症类型中上调，在癌细胞增殖和迁移中发挥重要作用[11]。然而，肾透明细胞癌中SNHG12的表达水平及其临床意义尚不清楚。本研究旨在探讨SNHG12在肾透明细胞癌中的表达水平及意义，利用生物信息学方法进行靶基因预测，为后续SNHG12在ccRCC中的机制研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 SNHG12在ccRCC中的表达及生存分析

利用UALCAN 数据库分析ccRCC 中SNHG12的表达水平，分析其与种族、性别、肿瘤分级之间的关系，并对SNHG12进行生存分析。采用logrank检验，运用Kaplan-Meier（KM plotter，http://www.kmplot.com）绘制生存曲线。

1.2 预测与SNHG12相互作用的microRNA

通过RegRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html）预测SNHG12序列上可能存在的mi⁃croRNA 结合位点。以最小折叠自由能（minimum folding freeenergy，MFE）≤-20、score 值≥150 为标准进 行 预测，score值为lncRNA 与microRNA 配对得分，得分越高表示两者的结合能力越强。同时，通过HMDD v3.0（http://www.cuilab.cn/hmdd）检索分析与ccRCC 有关的microRNAs，取此2 种分析结果的交集预测在ccRCC 中可能与SNHG12相互作用的microRNAs。用starBase v3.0 数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）探究SNHG12与mi⁃croRNA 表达水平的相关性。

1.3 预测microRNA靶基因

用starBase v3.0数据库、Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_61/）及microT-CDS（http://www.microrna.gr/webServer）在线分析平台预测mi⁃croRNA 的靶基因。取3个平台预测交集以避免产生过多假阳性结果，进一步分析其调控网络。

1.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs相互作用网络的构建

分别预测SNHG12潜在调控的microRNAs，分析其可能调控的mRNAs，通过Cytoscope 平台整合SNHG12、microRNAs 和mRNAs 三者信息，构建SN⁃HG12-microRNAs-mRNAs 网络调控关系。

1.5 microRNA靶基因的功能分析

靶基因的生物学功能分析利用FunRich（http://www.funrich.org/）平台进行，Gene Ontology（GO）中的细胞组分（cell component）、分子功能（molec⁃ular function）和生物过程（biological process）条目以及Pathways 中的KEGG 通路条目被用于分析。

2 结果

2.1 SNHG12在ccRCC中的表达水平及与患者生存时间的关系

利用UALCAN 数据库分析发现ccRCC 中的SNHG12表达量明显增高（图1A，P＜0.001），各肿瘤分级均比正常对照表达增高（图1B，P值均小于0.001），但分级之间SNHG12的表达水平无差异（图1B，P值均大于0.05）。SNHG12表达量在男女性别之间有差异，男性患者的表达更高（图1C，P＜0.001）。此外，不同人种ccRCC 患者间SNHG12的表达无明显差异（图1D，P值均大于0.05）。生存曲线结果显示SNHG12高表达患者的总生存期（overall survival，OS）较低表达患者明显缩短（图2，P=0.0049）。

图1 SNHG12 在ccRCC 中的表达水平

2.2 与SNHG12相互作用的microRNAs

RegRNA2.0 生物学软件预测显示，共有273 个microRNAs 能 够 与SNHG12结 合。HMDD v3.0 数据库检索发现18 个与肾肿瘤有关的microRNAs，分别为hsa-mir-106a、hsa-mir-138、hsa-mir-141、hsa-mir-155、hsa-mir-183、hsa-mir-192、hsa-mir-200c、hsa-mir-203、hsa-mir-21、hsa-mir-215、hsamir-23b、hsa-mir-27a、hsa-mir-381、hsa-mir-454、hsa-mir-590、hsa-mir-34a、hsa-mir-362、hsa-mir-497。其 中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p与SNHG12结合的可能性非常大。用starBase v3.0 数据库探究SNHG12与mi⁃croRNA 表达水平的相关性，结果显示SNHG12在ccRCC 中的表达水平与hsa-miR-138-5p、hsamiR-454-3p、hsa-miR-497-5p均呈正相关（r值分别为0.124、0.094、0.085，P值均小于0.05）（图3）。

2.3 microRNAs-mRNAs调控网络

通 过targetscan、starBase v3.0 及microT-CDS平台共同预测这3 个microRNAs 的靶基因，结果显示可能存在288 个靶基因受这3 个microRNAs调控。其中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p和hsa-miR-497-5p的靶基因分别有171、52、65 个。hsa-miR-138-5p的靶基因数量较多，可能参与更为复杂的调控通路。

图2 SNHG12 的表达与ccRCC 患者的生存关系

图3 SNHG12 与3 种microRNAs 的相关性分析

2.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs调控网络

结合以上SNHG12-microRNAs与microRNAsmRNAs网络，最终建立了SNHG12在ccRCC中的SNHG12-microRNAs-mRNAs调控网络，包括283个节点和291条边，283个节点代表1个SNHG12、3个microRNAs和279个mRNAs，291条边表示它们之间存在291种相互作用关系（图4）。SNHG12位于该网络中心，调节与之结合的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p，进而调控下游279个靶基因。其中hsa-miR-138-5p与hsamiR-454-3p共同调节CNOT6L、ZNF275、PLLP、ADCY1、ZEB2，hsa-miR-138-5p与hsa-miR-497-5p共同调节CCND3、PAPPA、MINK1，hsa-miR-454-3p与hsa-miR-497-5p共同调节ZNF609。

2.5 microRNA靶基因的功能分析

为预测SNHG12可能参与的生物过程以及信号通路，将参与SNHG12-microRNAs-mRNAs的3个microRNAs靶基因提交到FunRich平台，进行GO及KEGG pathway功能分析。GO分析结果显示，microRNA靶基因在碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢调节过程高度富集（图5）。KEGG pathway分析显示，microRNA靶基因高度富集到内皮素（endothelins）、IFN-γ等介导的信号通路。

图4 SNHG12-microRNAs-mRNAs 网络调控图

3 讨论

后基因组时代，lncRNA 已经成为阐明癌症复杂机制的研究重点[12]。lncRNA 参与一系列生物学功能[13]，迄今已有数千种lncRNA 被证实通过与其他分子的相互作用来驱动许多重要的癌症表型[12,14-15]。带有microRNA 结合位点的RNA 转录物可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），特异性竞争microRNA 相互作用并调节彼此的表达水平[16]。ceRNA 调节模式在各种癌症中被证实[17]，表明肿瘤发生过程中lncRNA和microRNA 之间存在相互作用。癌与对应癌旁组织中具有差异表达的lncRNA、microRNA 和mRNA 可为ccRCC 中潜在生物标志物提供更多的信息。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因的成员，位于染色体1p35.3，在子宫内膜癌中被首次报道在癌组织中上调[18]。SNHG12还可通过与HuR 结合，促进神经胶质瘤细胞的增殖和迁移[19]；作为miR-424-5p的内源性分子海绵促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[20]；通过结合miR-195-5p上调Notch2促进骨肉瘤的肿瘤发生和转移[21]；c-MYC 诱导SNHG12上调促进细胞增殖并抑制三阴性乳腺癌细胞凋亡，并通过调节乳腺癌中MMP13的表达促进细胞迁移[22]；在肝细胞癌中，SNHG12通过与miR-199a/b-5p作用调节MLK3的表达并影响NF-κB 途径来促进肿瘤发生和转移[23]。然而，SNHG12在ccRCC 中的表达和功能尚不清楚。

图5 microRNA 靶基因的GO 聚类分析

本研究以SNHG12为目标基因，利用UALCAN数据库分析SNHG12在ccRCC 中的差异表达，并对SNHG12进行生存分析。结果表明，ccRCC 组织中SNHG12的表达明显高于癌旁正常组织，各肿瘤分级均比正常对照表达增高，但SNHG12的表达与肿瘤分级无关，男性患者表达量高于女性患者，表达量具有性别差异，为SNHG12成为ccRCC的生物标志物奠定了基础。此外，SNHG12高表达ccRCC 患者的总生存期明显短于低表达患者，表明SNHG12具有作为评估ccRCC 预后的潜力。

通过功能分析和生物信息学预测探讨了SN⁃HG12的调节信息轴。用RegRNA2.0 生物学软件、HMDD v3.0 及starBase v3.0 数 据库，发现SNHG12上 存在hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsamiR-497-5p这3 种 与ccRCC 相 关microRNAs 的 可能结合位点，从而调节下游的288 个靶基因，构成SNHG12-microRNAs-mRNAs 调控网络，它们相互作用并调节彼此的表达水平，为研究SNHG12在ccRCC 中的作用机制提供了基础。microRNA 靶基因在碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢调节过程中高度富集，表明其在生物学过程中发挥作用。KEGG pathway 分析中，microRNA 参与内皮素、IFN-γ等介导的信号通路，这些信号通路均与肿瘤 相 关[24]。von Brandenstein 等[25]报 道，内 皮 素-1可诱导产生NF-κBp65/MAPKp38α/PKCα 转 录复合物，PKCα 通过 与pri-miRNA 茎环 结合而阻 止microRNA 成熟，从而对肾细胞癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种肿瘤进行调节。此外，内皮素-1 信号通路可通过EDNRA和EDNRB起作用，并在多发性骨髓瘤中过表达[26]。

本研究阐明了SNHG12具有作为ccRCC 生物标志物的潜力，利用生物信息学方法进行靶基因预测，构建了SNHG12-microRNAs-mRNAs 相互作用网络，为后续SNHG12在ccRCC 中的机制研究提供了借鉴。但值得注意的是，本研究仍存在一定的局限性。SNHG12的生物学作用尚未通过体内实验确定，通过生物分析软件及在线预测软件对lncRNA 靶标预测可能存在假阳性，该分析结果还需要进一步分析或实验验证。