RBM10通过影响miR-21稳定性参与调控人乳腺癌细胞增殖及转移活性

刘涵，李天牧，李晓达

1.首都医科大学 附属复兴医院肿瘤内科，北京100038；2.民航总医院 外一科，北京100123

microRNA（miRNA）是一类18～22 个核苷酸的非编码小RNA，通过与mRNA 完全或不完全互补使靶mRNA 降解或抑制其翻译，广泛参与体内众多生理和病理过程。在已发现的miRNA 中，miR-21 由于在众多疾病中表达异常而引起医学界重视。miR-21 在多种恶性肿瘤中表达上调，并通过复杂的调控参与肿瘤的发生、发展[1-4]，这预示miR-21 对癌症的诊断与治疗具有重要研究价值。miR-21 由染色体17q23.2 脆性位点FRA17B上的单基因编码，含22 个核苷酸，从约3400 个核苷酸的前转录本体中分离出来。miR-21 的加工过程与大多数miRNA 一样，都是经由初始miRNA（pri-miRNA）到miRNA 前体（pre-miRNA），最终被切割形成成熟miRNA。miR-21 基因所在的17q染色体区域的扩增与包括乳腺癌在内的许多肿瘤有关。但在许多miR-21 增高的癌组织中编码它的基因并没有扩增[5]，所以癌组织中miR-21 高表达与其基因的扩增并无明确联系，提示miR-21表达失调可能与转录或转录后调节有关。换句话说，到目前为止，miR-21 在肿瘤组织中的高丰度存在尚无明确机制。

近年来，RNA 结合基序（RNA binding motif，RBM）受到广泛关注[6]，其中RBM5 被认为是潜在的肺癌抑制基因[7]，为肺癌的早期诊断、靶向治疗及化疗耐药带来了新希望。因此，更多研究者开始探索RBM 家族其他成员与肿瘤的相关性。而同属RBM 的RBM10 与RBM5 结构相似[7]，具有高度同源性，昭示其作为潜在抑癌基因的潜力。然而RBM10 到底是抑癌还是促癌，目前存在很大争议[8-12]。我们以乳腺癌细胞为模型，揭示了RBM10的异常表达以及与miR-21 间的关系，从另一个角度展示了RBM10 在乳腺癌细胞中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231 和永生化的人乳腺正常上皮细胞MCF-10A（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；胎牛血清、DMEM 和DMEM/F12培养基、LipofectAMINE 2000转染试剂（Invitrogen 公司）；人表皮细胞生长因子、氢化可的松、胰岛素（Sigma 公司）；NC-siRNA、RBM10-siRNA（上海吉玛公司）；All-in-One miR⁃NAqRT-PCR 检测试剂盒（GeneCopoeia 公司）；兔抗人RBM10 一抗（Abcam 公司）；兔抗人GAPDH一抗、HRP 标记羊抗兔二抗（中山金桥公司）。

1.2 Oncomine数据库提取数据

筛选条件如下：①Cancer Type：Breast Can⁃cer；②Gene：RBM10；③Data Type：mRNA；④Sam⁃ple Type：Clinical Specimen；⑤Analysis Type：Can⁃cer vs.Nomial Analysis；⑥临界值设定条件：Pvalue＜1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%。选择柱状图展示结果。

1.3 miRNA肿瘤组织表达分析

利用starBase 泛癌分析平台（http://starbase.sy⁃su.edu.cn/panCancer.php）挖掘来自癌症基因组图谱（TCGA）的不同癌症类型的mRNA 或miRNA 表达谱。

1.4 细胞培养与细胞转染

MCF-7 和MDA-MB-231细胞采用DMEM 培养基、MCF-10A 细胞采用DMEM/F12 培养基（添加10%胎牛血清、10 μg/mL 胰岛素、500 ng/mL 氢化可的松、20 ng/mL 表皮生长因子、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素），在37℃、含5% CO2孵箱中培养。调整细胞密度，接种无菌6 孔板，每孔约1×106细胞。待其生长至80%融合时，按Lipo⁃fectAMINE 2000 脂质体转染试剂盒说明书进行操作，转染20 nmol/L siRNA 或miRNA 到细胞中，分别作为转染组（RBM10-si）和阴性对照组（NC）。siRNA 及miRNA 序列包括NC-siRNA（正义链）（5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′）、RBM10-siRNA（正义链）（5′-ACCGGGACAUGGACUACCG dTdT-3′）、NC mimic（5′-CAGUACUUUUGUGUAG UACAA-3′）、miR-21-5p（5′-UAGCUUAUCAGAC UGAUGUUGA-3′）。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

按照说明书，用TRIzol 提取细胞总RNA。采用2 μg 总RNA 进行反转录，qPCR 检测目的基因及pri-miRNA 的相对含量，GAPDH 为内参。利用All-in-One miRNA qRT-PCR 检测试剂盒检测成熟miRNA 和pre-miRNA 的相对含量，U6 为内参。使用引物序列包括miR-21（正向：5′-TAGCTTAT CAGACTGATGTTGA-3′；反向：5′-GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3′）、RBM10（正向：5′-CTTCGC CTTCGTCGAGTTTAG-3′；反向：5′-GCTTGGGGTC ACTGTAGTGC-3′）、GAPDH（正向：5′-GGTGGTC TCCTCTGACTTCAA-3′；反向：5′-GTTGCTGTAGC CAAATTCGTTGT-3′）、U6（正向：5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′；反 向：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′）。

1.6 细胞中蛋白表达检测

收集细胞，加人适量RIPA 裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1%去氧胆酸钠，1 mmol/L EDTA，0.1% SDS，0.2 mmol/L PMSF，1 μg/mL 蛋白酶抑制剂］，于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min 离心20 min，收集上清，用BCA 法测定蛋白质浓度，用12% SDSPAGE 分离蛋白；转膜至PVDF 膜，用1×TBST 配制5%的脱脂奶粉封闭1 h，按要求稀释一抗，室温孵育2 h，1×TBST 洗4 次，每次10 min，室温孵育山羊抗兔带HRP 标记的IgG（1∶8000 稀释），洗膜5 次，每次10 min，用增强发光液在化学发光成像系统中发光显色。

1.7 细胞迁移实验

取对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，以5×105/孔接种于6 孔板，37℃培养过夜后，进行实验处理。继续培养24 h，消化细胞制备单细胞悬液，稀释为2×105/mL，每种细胞种3 个小室，每个小室中加入200 μL 细胞，在24 孔板中加入500 μL 含10%胎牛血清的培养基作为下液，将Tran⁃swell 小室放入孔中，继续培养12～24 h 取出小室；用棉签擦去小室内表面上未穿膜的细胞，甲醇固定15 min，DAPI 染核10 min，用PBS 洗3 次；于荧光显微镜下观察，不同视野下计数细胞，共计数5个视野，统计结果。

1.8 细胞侵袭实验

将冻存于-80℃冰箱的Matrigel 于4℃过夜（24 h）使其变成液态。取300 μL 无血清培养基，加入60 μL（或50 μg/每室）Matrigel，4℃混匀，加入Transwell 小室各100 μL（3 个室），在37℃培养箱中孵育4～5 h 至基质胶形成固态，其余步骤同细胞迁移实验。

1.9 miRNA稳定性实验

将细胞接种于12 孔板，37℃、5% CO2下培养24 h。用放线菌素D（10 mg/L）处理细胞，分别于0、4、8、12 和24 h 从细胞中分离总RNA，RT-qP⁃CR 检测miRNA 的相对丰度。

1.10 统计分析

用SPSS-16.0 软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，组间数据比较采用t检验分析和方差分析，多重比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RBM10和miR-21在乳腺癌组织中的表达水平分析

同时用Oncomine 和starBase 数据库分析RBM10 在乳腺癌中的表达数据。2 个数据库的分析结果一致，显示RBM10 在乳腺癌中的mRNA 相对水平显著高于癌旁组织或正常对照组织（图1A、B）。用starBase 数据库分析miR-21 在乳腺癌中的表达情况，结果显示miR-21 也在乳腺癌组织中高表达（图1C），且miR-21 与RBM10 呈共表达正相关趋势（图1D）。

2.2 RBM10和miR-21在乳腺癌细胞中的表达水平分析

以人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231 及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A 为细胞模型，用实时定量PCR 检测RBM10 及miR-21 在不同细胞中的表达差异。结果显示RBM10 和mIR-21 在2 种乳腺癌细胞中相对于MCF-10A 细胞均呈显著高表达（图2），与其在乳腺癌组织中的表达趋势一致。

图1 利用数据库分析RBM10 和miR-21-5p 在乳腺癌组织中的表达

图2 实时定量PCR 检测RBM10 和miR-21 在MCF-7、MDA-MB-231 和MCF-10A 细胞中的相对表达（*P＜0.05）

2.3 RBM10参与调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移

在MCF-细胞7 中转染RBM10 siRNA 后，能够特异下调RBM10 mRNA 和蛋白表达水平（图3）。同时，随着RBM10 表达下调，MCF-7 细胞增殖减慢（图4A），迁移和侵袭能力也受到抑制（图4B、C）。但是，如果在利用siRNA 下调RBM10 的同时转染miR-21，上述对MCF-7 细胞的抑制效应被部分减弱（图4B、C）。这些结果揭示了RBM10参与调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移，同时发生的调节通路与miR-21 密切相关。

图3 RBM10 siRNA 对RBM10 的敲低效应

图4 RBM10 参与调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移

2.4 RBM10在乳腺癌细胞中调控miR-21的稳定性

用RBM10 siRNA 处理MCF-7 细胞后，miR-21 的相对含量随之下调（图5A）。进一步检测发现，miR-21 的初始转录本（pri-miR-21）和前体（pre-miR-21）并没有受RBM10 含量变化的影响（图5B、C）。用放线菌素D 处理细胞进行RNA 稳定性检测实验，结果显示RBM10 被siRNA 下调后，miR-21 成熟体的稳定性显著下降（图5D）。至此，上述实验结果揭示RBM10 通过调控miR-21 成熟体的稳定性影响miRNA-21 的相对含量。

3 讨论

RBM 是新近发现的结构功能相似的RNA 结合蛋白基序家族，是由HUGO 基因命名委员会正式命名的RRB/RBM/RNP 蛋白的亚群。研究显示RBM 可与RNA 结合，与mRNA 的剪接、翻译和稳定性有关，尤其在调控凋亡细胞中的重要作用受到广泛关注。RBM 的主要结构包括被称为RNA识别基序的RRM、一个共同序列RNA 结合域（CS-RBD）、核糖蛋白域（RNP）和一个RNP 共同序列（RNP-CS）。这些结构有助于RBM 蛋白参与前mRNA 的处 理、mRNA 的拼 接 和mRNA 的稳 定性翻译。

图5 RBM10 影响miR-21 的稳定性

随着研究的进展，RBM 成员越来越多，研究得较多的主要有RBMY、RBM3、RBM5、RBM6、RBM10、RBM12 及RBM15。其 中RBM10 和RBM5都具备D111/G-补片和一个锌指结构，提示2 种蛋白之间结构的高度重叠性[6]。目前认为RBM5参与多种细胞生物功能，同时也与肿瘤的生长、发展密切相关，被认为是潜在的肿瘤抑癌基因，是一种分布于细胞核，具有识别、结合mRNA 功能的蛋白，可参与机体内mRNA 翻译、基因表达调控，以及调控细胞增殖和细胞周期，而目前发现它最重要的特征是通过调控凋亡抑制肿瘤细胞的生长[13-15]。对RBM10 的研究相对较少。最初发现RBM10 在部分肿瘤中存在突变，于是将突变与肿瘤相关联，揭示了RBM10 作为肿瘤抑制因子的相关作用。然而近期越来越多的研究却表明RBM10 的促癌作用[20-21]。这些截然相反的实验结果提示我们不仅要深入了解RBM10 表达的下游后果，还要确定负责调节RBM10 本身的机制，对RBM10 的功能研究不能脱离具体环境。

本研究以乳腺癌为模型，通过Oncomine 和starBase 数据库首先分析了RBM10 和miR-21 在乳腺癌中的高表达，随后在乳腺癌细胞中证明了它们的共表达相关性，进一步揭示了RBM10 通过调控miR-21 的稳定性影响乳腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。

RBM10 作为一个RNA 结合蛋白，是否与miR-21 直接相互作用？RBM10 与miR-21 的调控模式在其他肿瘤中是否存在？RBM10 的其他家族成员是否也具有调控miRNA 的能力？这些问题都需要进一步深入研究，以便揭示miRNA 调控网络的复杂性和RBM 家族的功能多样性。