利用CRISPR/Cas9技术构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株及其功能鉴定

张亚楠，常振宇，刘婕，丁丽华，叶棋浓

1.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850；2.解放军总医院 肝胆外二科，北京100853

肝癌是常见的消化系统肿瘤之一，其死亡率和发病率都呈逐渐上升的趋势，已经成为仅次于胃癌和食道癌的第三大常见恶性肿瘤[1]。我国肝癌新发案例占全球的59%，发病率是全球平均发病率的3 倍，确诊之后5年生存率仅为10%。

四个半LIM 结构域（four and a half LIM do⁃mains，FHL）蛋白1（FHL1）属于FHL 家族，后者是LIM 超家族中只含有LIM 结构域的蛋白家族[2]。LIM 是Lin-11、Isl-1 和Mec-3 这3 种同行域（home⁃odomain）蛋白质的首字母缩写。LIM 结构域是富含半胱氨酸的双锌指结构[3]，通过介导某些结构蛋白、激酶、转录调控因子等多种蛋白质相互作用，对某些基因的表达、细胞分化与发育、细胞骨架形成等发挥重要的调控作用[4]。

成簇的规律间隔的短回文重复序列（clus⁃tered regularly interspaced short palindromic re⁃peat，CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9 核酸酶（CRIS⁃PR-associated protein 9，Cas9）是以细菌与古生菌抵御外源病毒入侵获得性免疫为基础的基因编辑新技术[5]，经过人工改造后可灵活地对真核细胞进行特异的基因组编辑，具有操作简单、成本低、效率高和突变位点选择性强等优点，成为近年来分子生物学领域研究的热点技术之一[6]。本研究采用CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术，在人肝癌细胞系HepG2 中进行FHL1基因的敲除，通过对细胞增殖、迁移能力的检测，评价CRISPR/Cas9 基因编辑系统在肝癌细胞水平的基因靶向编辑效果，为今后研究FHL1 蛋白在肝癌细胞中的功能提供基因敲除的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞293T、人肝癌细胞HepG2、大肠杆菌DH5α和CRISPR/Cas9 载体（本实验室保存）；pPack Packaging Plasmid Mix 病毒包装载体（SBI公司）；BsmBⅠ限制性内切酶、T4DNA 连接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB 公司）；质粒提取试剂盒（Promega 公司）；胶回收试剂盒、细胞基因组提取试剂盒（康为世纪公司）；DMEM 高糖培养基（Gib⁃co 公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；抗FHL1的兔多克隆抗体（Proteintech 公司）；辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG、兔抗人GAPDH（Santa Cruz 公司）；小 向 导RNA（small guide RNA，sgRNA）序列合成、鉴定引物合成及质粒测序由北京博迈德基因技术有限公司完成。

1.2 sgRNA的设计

根据CRISPR/Cas9 基因编辑靶点设计原则，利用CRISPR 在线设计网站（http://crispr.mit.edu/），在人FHL1基因的第三外显子序列设计sgRNA。sgRNA 对应的靶序列长度应为20 bp，靶序列的3′端紧跟NGG 序列，最后选择网站评分最高的序列。根据设计的sgRNA 序列，在正义链模板的5′端添加CACC，反义链模板的5′端添加AAAC，使其均能与BsmBⅠ酶切后形成的黏性末端互补。同时根据靶点的位置设计了FHL1敲除效果鉴定引物。引物序列见表1。

1.3 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重组质粒的构建与鉴定

将LentiCRISPR 载体在37℃用BsmBⅠ酶切30 min，胶回收酶切后的载体。将合成的sgRNA引物12 000 r/m 离心后加入适量双蒸水，使引物的终浓度为100 μmol/L，充分溶解后用T4多聚核苷酸激酶将sgRNA 引物退火成双链（反应体系：上、下游链各1 μL，10×T4DNA 连接酶反应缓冲液1 μL，双蒸水6.5 μL，T4多聚核苷酸激酶0.5 μL；反应条件：37℃ 30 min，95℃ 5 min，然后以5℃/min 的速度降至25℃）。用T4DNA 连接酶将退火后的双链插入酶切后的LentiCRISPR 载体（反应体系：酶切的LentiCRISPR 载体1 μL，退火形成的sgRNA 寡核苷酸双链1 μL，10×T4DNA 连接酶缓冲液1 μL，T4DNA 连接酶缓冲液1 μL，双蒸水6 μL；室温连接30 min）。取连接产物转化100 μL 大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB 平板筛选，挑取单克隆测序鉴定。

表1 合成寡核苷酸序列

1.4 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA慢病毒的包装与感染

将293T 细胞接种于6 孔板，以转染时密度为50%～70%为宜；24 h 后转染细胞，将1 μg Lenti⁃CRISPR-FHL1-sgRNA 质 粒 或LentiCRISPR 质 粒 与0.84 μg PLP1、0.4 μg PLP2 及0.56 μg VSVG 加入200 μL 不含血清双抗的DMEM 中，振荡混匀，加入10 μL Megatran 1.0 转染试剂，再次振荡混匀；室温静置10 min，将上述混合物加到种有293T 细胞的6 孔板中，37℃温箱培养，48 h 后收集上清；取300 μL 病毒上清滴加到准备好的密度约为60%的HepG2 细胞培养基中，24 h 后换液，再次滴加300 μL 病毒上清进行二次感染，培养24 h 后换成带有嘌呤霉素的DMEM 培养基进行筛选；加药1 周后，将带有抗性的单克隆集落用枪头吸取吹散于24 孔板中，长满后传至小皿培养。

1.5 单克隆细胞基因组DNA的提取及鉴定

待小皿中的单克隆细胞长满后，收取部分细胞，提取基因组DNA，将基因组DNA 作为模板，与设计的鉴定引物构成体系进行PCR 反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，连接pBM23-T 载体，转化涂板，挑取不同单克隆测序鉴定。

1.6 Western印迹检测HepG2FHL1基因稳定敲除细胞株

收取部分对照和FHL1敲除的HepG2 细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰浴30 min，加入等体积的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮15 min，进行SDS-PAGE；电泳结束后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，FHL1 抗体 和GAPDH 抗 体室 温 孵 育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；再用辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG 孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；化学发光法显色5 min，压片显影。

1.7 生长曲线实验

将对照细胞株和FHL1敲除的HepG2 细胞分别消化和计数，接种至96 孔板中，每组实验设计3 个复孔，每孔细胞约3000 个。在设定好的各个时间点，每孔加入10 μL Cell Counting Kit 8 试剂，37℃静置1 h，取出后测定样品的D450nm值。

1.8 细胞划痕实验

将对照细胞株和FHL1敲除的HepG2 细胞分别消化，接种至6 孔板中，待细胞长满后，用无菌移液器枪头在孔中划出3 条横线，弃去培养基，PBS 清洗细胞2 次，去除残留的细胞，然后加入含0.5%胎牛血清的DMEM 培养基进行培养，于0、24 h 拍照，观察细胞距划痕中心的距离。

1.9 统计分析

实验所有数据采用x±s表示。数据处理运用SPSS 17.0 统计软件，采用重复测量资料的方差分析，两组间均数比较采用t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重组质粒的测序鉴定

将构建的重组质粒用U6 引物测序鉴定，结果显示FHL1sgRNA 成功插入LentiCRISPR 载体，经序列比对，图1 虚线框内的序列与设计的sgRNA序列完全一致，说明LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重组质粒构建成功。

2.2 Western印迹检测HepG2FHL1基因敲除细胞株内FHL1蛋白的表达

将LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 包装的慢病毒感染HepG2 细胞，嘌呤霉素筛选后进行无限稀释，待单克隆细胞长满小皿后，挑取4 个细胞克隆，用Western 印迹检测FHL1 的表达（图2）。结果显示，第2 个单克隆细胞中FHL1 蛋白完全没有表达。分别提取对照细胞和第2 个单克隆细胞的基因组DNA，用设计的鉴定引物进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳后测序鉴定。结果显示，与对照细胞基因组DNA 相比，FHL1sgRNA 于第三外显子产生了7 bp 缺失突变，可以改变FHL1基因的开放读框，从而终止FHL1 蛋白的翻译（图3）。结果说明HepG2 细胞FHL1基因敲除稳定细胞株构建成功，将其命名为HepG2-FHL1-KO 细胞。

图1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重组质粒测序结果

2.3 生长曲线实验检测HepG2-FHL1-KO细胞增殖速度的变化

将HepG2-FHL1-KO 细胞和对照细胞接种于96 孔板，用Cell Counting Kit 8 试剂盒检测敲除FHL1对HepG2 细胞增殖的影响。结果表明，与对照细胞相比，敲除FHL1可以显著促进HepG2 细胞的增殖（图4），差异具有统计学意义。

2.4 细胞划痕实验检测HepG2-FHL1-KO细胞迁移能力的变化

通过划痕实验比较对照细胞和FHL1敲除的HepG2 细胞的迁移能力，结果显示，敲除FHL1可以明显促进HepG2 细胞的迁移（图5），差异具有统计学意义。

3 讨论

肝癌是一种难发现、难诊断、难治疗、发展快和预后差的恶性肿瘤，5年生存率只有10%左右，严重威胁人类的健康和生命。手术治疗、放射治疗和药物治疗是目前肝癌治疗中的3 种常规方法，但这些治疗方式都存在一定的局限性：手术治疗不适用于很多中晚期肝癌患者；放射治疗对患者正常组织损伤大且容易复发；药物治疗的毒副作用明显，较其他实体肿瘤更不敏感[7]。肝癌的发生发展是一个多基因、多通路共同参与的过程，近年来随着高通量测序和生物信息学的快速发展，我们可以很容易地从不同肿瘤细胞中获取基因组信息，分析比较不同基因在肿瘤细胞中所发挥的不同作用，从而使得针对肝癌的基因治疗成为可能。

图2 Western 印迹检测单克隆细胞中FHL1 蛋白的表达

图3 对照细胞（A）和第2 个单克隆细胞（B）基因组DNA 测序结果

RNA 干扰（RNAi）技术，是由双链RNA 介导，引起同源mRNA 高效特异性降解，抑制特异性基因的表达。作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，RNAi 在探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域得到广泛应用[8]。但RNAi技术也存在一定的局限性，如不彻底性、插入染色体位置不确定性和存在脱靶效应等，会在一定程度上影响我们对基因功能的研究。

图5 划痕实验检测HepG2-FHL1-KO 迁移速度的变化

CRISPR/Cas9 技术是近年出现的一种基因编辑技术，以细菌和古生物菌体内的免疫防御机制为基础，经过改造，已经成功地在人、小鼠、水稻和斑马鱼等生物上得到广泛应用[9]。相较于RNAi、锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN）技术，CRISPR/Cas9 技术具有设计简单、操作方便、细胞毒性小和基因编辑效率高等特点，迅速成为基因治疗领域的一种新手段[10]。

FHL1家族共有FHL1[11]、FHL2[12]、FHL3[13]、FHL4[14]、FHL5/ACT[15]等5 个成员，它们表达分布于不同组织中。FHL1 在该家族中表达最为广泛，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。研究发现，FHL1 在脑、乳腺、肝、肺、肾、前列腺和皮肤等人组织肿瘤中的表达水平下降；FHL1 通过参与TGFβ信号途径，调节下游靶基因p21 和c-Myc 的表达，抑制肝癌的发生发展[16]；FHL1 通过与雌激素受体（ER）相互作用，抑制ER 的转录活性，从而抑制乳腺癌细胞的生长[17]；FHL1 和Smad4 可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）的转录活性，从而抑制VEGF 的表达[18]。

本研究采用CRISPR/Cas9 技术构建了Lenti⁃CRISPR-FHL1-sgRNA 重组质粒，包装病毒感染HepG2 细胞，经嘌呤霉素筛选得到阳性细胞，Western 印迹检测FHL1 蛋白的表达，提取细胞基因组DNA 进一步测序鉴定，最终构建了HepG2FHL1基因敲除稳定细胞株，同时用生长曲线实验和细胞划痕实验检测了细胞增殖和迁移能力的变化。结果表明，FHL1基因敲除的稳定细胞株的增殖和迁移能力均有显著提升，这与报道的FHL1在肝癌中的抑癌作用一致。综上，HepG2 细胞FHL1基因敲除稳定细胞株模型的建立，为进一步研究FHL1基因在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。