不同培养条件对金线莲多糖含量的影响

施满容

摘要：以金线莲试管苗为材料，MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖25 g/L为基础培养基，采用SPSS正交设计试验，研究不同添加物、不同瓶子规格、不同光质等对金线莲试管苗生长过程中多糖含量积累的影响。结果表明，影响金线莲多糖含量的顺序为光质>添加物>瓶子规格。添加物中香蕉泥的均值最大为0.291，并且香蕉泥与苹果汁和胡萝卜汁之间具有显著性差异（P<0.05）。光质中蓝光的均值最大为0.289，并且蓝光与白光和红光之间具有显著性差异（P<0.05）。瓶子规格中6.5 cm的均值最大为0.279，与8.0 cm瓶子对比有显著性差异（P<0.05），与9.0 cm瓶子对比没有显著性差异（P>0.05）。优化后金线莲多糖含量累积的培养条件为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖25 g/L+香蕉泥（pH 5.8）50 g/L+6.5 cm培养瓶+蓝光。

关键词：金线莲；组织培养；多糖含量

中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）04-0113-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.029

Effects of Different Culture Conditions on Polysaccharide Contents

in Anoectochilus roxburghii

SHI Man-rong

（Ningde Vocational and Technical College，Fuan 355000，Fujian，China）

Abstract： The in vitro plantlets were used as the materials，and MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+7 g/L agar+25 g/L glucose was used as the basal medium for studying the effects of organic additives， bottle sizes and light qualities on the accumulation of polysaccharide content during the growth of in vitro plantlets by the L9（34） orthogonal experimental design during in Anoectochilus roxburghii. The results showed that the order of polysaccharide content was light quality>additive>bottle size. The average value of banana mud in the additive was 0.291，and there was a significant difference between banana mud and apple juice and carrot juice（P<0.05）. The mean value of blue light in the light mass is 0.289， and there is a significant difference between blue light and white and red light （P<0.05）. The mean value of 6.5 cm in the bottle size was 0.279，which was significantly different from that of the 8.0 cm bottle（P<0.05），and there was no significant difference（P>0.05）. Consolidated results showed that the best culture conditions for the accumulation of polysaccharide content was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L agar+25 g/L glucose+50 g/L banana（pH 5.8） in the culture bottle with 6.5 cm diameter in the blue light.

Key words： Anoectochilus roxburghii； tissue culture； polysaccharide contents

金線兰[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.]俗称金线莲，为单子叶植物纲兰科开唇兰属植物，在中国福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，享有“药王”“金草”“鸟人参”“神药”等美称[1]。金线莲中含有丰富的多糖，是其药用成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、增强免疫功能等作用[2]，是一种天然抗氧化剂。福建省金线莲产业规模持续快速扩大，已经成为福建省特色中草药产业之一。市场上的金线莲产品多数是采用组织培养技术进行种苗生产，由于组织培养条件和后期大田种植管理的差异，对金线莲有效成分积累产生很大的影响。目前，市场上还没有形成一套完整的适用于金线莲生产的质量标准，难以对金线莲有效药用成分和品质进行控制，导致市场上的金线莲产品参差不齐。

金线莲多糖含量是金线莲产品质量标准的重要控制成分，不同培养条件会影响金线莲多糖含量变化。如黄瑞平等[3]通过对不同组培苗0和4月龄的金线莲进行多糖和总黄酮含量的测定，结果表明，总黄酮含量随着金线莲栽培月龄的增加而上升，多糖含量则随着金线莲栽培月龄的增加而降低。杨翠芹等[4]研究表明，在4%的蔗糖浓度下对金线莲多糖积累最有利；随继代天数的延长，多糖含量表现出先减少后增加的趋势。牛蓓等[5]在同一光照度和几种不同温度下对金线莲进行处理，结果显示金线莲多糖含量在25 ℃时最大，35 ℃时最小。为了研究影响金线莲多糖含量变化的因素，本试验在原有试验配方确定的基础上，采用天然添加物、光质、瓶子规格3个因素进行正交设计试验，旨在探索最有利于金线莲组织培养过程中多糖含量积累的有效培养条件，为生产上提高金线莲多糖含量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为福建金线莲组培苗，MS为基础培养基，25 g/L蔗糖为碳源，7 g/L琼脂为凝固剂，pH 5.8，添加6-BA 3.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L作为继代培养基，对金线莲试管苗进行扩繁。

1.2 试验方案

根据正交试验设计L9（34）（表1）得到的9个处理进行试验[6]，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L琼脂+25 g/L蔗糖为基础培养基，每处理接种5瓶，每瓶接6个带2个芽的金线莲茎段，每处理重复3次。培养温度25±2 ℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d。培养60 d时，利用苯酚-硫酸法测多糖含量。采用SPSS数据处理软件进行分析，优选出有利于金线莲多糖积累最佳试验因素组合。

1.3 多糖含量的测定

1.3.1 标准曲线的制作 称取葡萄糖25 mg，置于250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，由葡萄糖标准溶液稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL的浓度，终体积为1.0 mL。取一支试管加入1.0 mL的去离子水作为空白对照管。在各个试管中分别加入5%苯酚液1 mL、5 mL浓硫酸，振荡摇匀后放置5 min，再置沸水浴中15 min，取出后冷却至室温。以空白对照管液体为对照调0。在最大吸收波长490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程y=1.408 9x-0.036 8，R2=0.993 7，制作标准曲线见图1。

1.3.2 多糖样品溶液的制备 多糖样品溶液制备参照王学奎[7]、林丽清等[8]、杨翠芹等[4]报道的苯酚-硫酸法。分别称取烘干至恒重的金线莲干粉0.025 g，加去离子水25 mL，于沸水中静置提取3 h。提取后于4 000 r/min离心20 min，转移上清液5 mL置于新的离心管中，在滤液中加入80%的乙醇，放置在 4 ℃冰箱中过夜，弃上清液，得白色沉淀物。再将移出的液体进行离心，离心后用移液枪将上清液体移走，留下白色沉淀物，用3 mL 80%的乙醇将此次沉淀洗入上一次沉淀中，用去离子水将沉淀溶解定容至10 mL，得到粗多糖样品溶液。

将制得的多糖样品溶液各取1 mL移入20 mL试管中，步骤同“1.3.1”中以0号空白对照管液体为对照空白调0。重复3次，在490 nm处测得吸光度。以转换系数0.9校正多糖含量，根据公式计算多糖含量。多糖含量=（C×0.9×Vr×N/W×Vs×1 000）×100%，式中，C：从标准曲线查得的糖量（mg）；0.9：葡萄糖转化系数；Vr：提取液体积（mL）；N：稀释倍数；W：测定时取用的样品重量（g）；Vs：测得时取用的样品体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 不同处理对金线莲试管苗多糖含量影响

正交试验得到的9个金线莲样品，进行多糖含量测定，3次重复，结果见表2。

运用SPSS软件对获得的数据进行分析[9，10]，表3为方差齐次性检验的结果，从显著性概率来看，P>0.05，说明各组方差在α=0.05水平没有显著性差异，也就说明了方差具有齐次性。

根据试验结果进行主体间效应分析，结果（表4）表明，在α=0.05水平上，添加物、瓶子规格、光质这3种不同因素的培养条件对金线莲多糖含量的积累具有极显著性差异。比较3个因素的F值可以看出，影响金线莲多糖含量的因素顺序為光质>添加物>瓶子规格。光质对金线莲试管苗多糖含量影响表现最为明显。

2.2 不同添加物对金线莲试管苗多糖含量影响

不同添加物对金线莲多糖含量测定结果运用SPSS软件分析，同时选择具有齐次性的LSD法进行检验，结果见表5、表6。综合表5和表6可以看出，添加物中香蕉泥的均值最大为0.291，其次苹果汁，胡萝卜汁表现最差，香蕉泥与苹果汁和胡萝卜汁之间具有显著性差异（P<0.05）。说明选择香蕉泥作添加物对金线莲多糖积累有利，同时与苹果汁和胡萝卜汁之间差异显著。

试验过程中发现，在白光下培养的含有胡萝卜汁添加物的金线莲继代苗全部都会引起茎段下端褐化现象，而添加胡萝卜汁的金线莲在蓝光和红光下培养则不发生褐化现象。这说明金线莲组培中胡萝卜汁可能不是理想的添加物，特别不适合在白光下培养。

2.3 不同光质对金线莲试管苗多糖含量影响

不同光质处理金线莲组培苗多糖含量测定结果运用SPSS软件分析，同时选择具有齐次性的LSD法进行检验，结果见表7、表8。综合表7和表8可以看出，不同光处理后对金线莲多糖均值影响大小顺序为蓝光>白光>红光，光质中蓝光的均值最大为0.289，并且蓝光与白光和红光之间具有显著性差异（P<0.05）。数据分析表明，蓝光最有利于金线莲多糖含量积累。在培养过程发现，蓝光下培养的金线莲比较矮壮，白光下培养的金线莲叶面积比较大，红光下培养的金线莲较为细长，并且叶子边缘有白化现象出现。外部形态特征也表现蓝光最有利于金线莲苗健壮生长。

2.4 不同规格瓶子对金线莲试管苗多糖含量影响

不同规格瓶子培养的金线莲苗多糖含量测定结果运用SPSS软件分析，通过齐次性的LSD法进行检验，结果见表9、表10。综合表9和表10可以看出，采用不同大小瓶子培养金线莲苗，经金线莲多糖测定，对均值影响大小顺序为6.5 cm>9.0 cm>8.0 cm，瓶子规格中6.5 cm的均值最大为0.279，6.5 cm瓶子与8.0 cm瓶子对比有显著性差异（P<0.05），但是6.5 cm规格瓶子与9.0 cm瓶子对比没有显著性差异（P>0.05），表明6.5 cm规格的瓶子与9.0 cm的瓶子对金线莲多糖含量积累的促进作用相似，综合考虑各因素，选择直径为6.5 cm的瓶子更有利于提高经济效益。6.5 cm规格的瓶子可以节省培养基用量，同时也可充分利用培养架空间等优势。

3 讨论与结论

3.1 不同添加物对金线莲试管苗多糖积累效应不同

香蕉泥、苹果汁、胡萝卜汁、番茄汁、椰乳、马铃薯汁等是植物组织培养中常用的天然有机添加物[11]。这些常用的有机添加物都是一些成分较为复杂的天然复合物[12]，含有氨基酸、酶、生长调节剂等一些化学成分不明的有机物，其营养丰富，但不稳定，主要作用是为植物生长提供一些生理活性物质，补充一些未知的微量成分[13]。本试验通过对比分析发现，香蕉泥对金线莲多糖合成具有显著促进效应，而胡萝卜汁与苹果汁则对金线莲多糖的积累未起到明显作用，这可能是香蕉泥对pH具有较大的缓冲作用，并富含一些微量营养成分、生理活性物质和生长调节剂等[14]对多糖的合成有促进作用，具体是什么物质尚未见相关报告。而苹果汁与胡萝卜汁可能不含或较少含有此类促进多糖合成的物质或含有的天然有机物质经高压灭菌而变性，从而失去效果[15]。白光下含有胡萝卜汁培养基的金线莲出现褐变现象，影响金线莲的生长。推测可能胡萝卜汁中富含的某些多酚物质，在白光下更容易氧化褐变，在蓝光和红光中培养的添加胡萝卜汁的金线莲则不发生褐化现象。一般出现褐化的原因有光照、温度、培养基成分、培养时间、遗传因素等[16]，具体的影响因素还需后面进行试验观察探究。

3.2 蓝光最有利于金线莲试管苗多糖的积累

光质处理可以影响药用植物有效成分的含量。相关研究發现，蓝色光质对生物碱、黄酮、糖苷、萜类内酯等次生代谢物质有影响。如蓝色光质对长春花愈伤组织细胞核生物碱[17]和喜树幼苗叶片中喜树碱[18]积累有明显的促进作用；能促进水母雪莲愈伤组织中黄酮物质的合成[19]；有利于毛地黄叶组织培养物中强心苷[20]和白桦愈伤组织三萜[21]含量的积累。朱旭丹等[22]研究不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响，结果是白光下布朗葡萄藻多糖含量最高。高亭亭等[23]研究发现不同光质对铁皮石斛种苗和有效成分均有极显著的影响，红光有利于种苗根系与苗高生长，蓝光有利于种苗增粗与生物碱积累，红蓝混和光有利于叶绿素与多糖含量增加。郝俊江[24]等通过研究不同光质对灵芝生长发育和灵芝多糖含量的影响，表明蓝色光质处理可以提高灵芝多糖含量。本试验结果表明，蓝光最有利于金线莲多糖的积累，红光与白光则对金线莲多糖积累的影响不大。该结果与朱旭丹等[22]的研究情况不同，与高亭亭等[23]和郝俊江等[24]的研究结果有相似之处，可能是蓝光处理会促进金线莲对光波的吸收，一定程度上提高光合作用，从而更有利于光合产物多糖的积累。综合试验的3个因素，表明光质对金线莲多糖的影响最大。

3.3 瓶子规格对金线莲多糖积累有影响

在组织培养过程中，培养容器中的气体成分及含量影响培养物的生长和分化。组织培养的植物主要通过呼吸作用、物质转换、能量代谢来实现正常生长，组培苗的绿色组织也会进行光合作用，但光合能力弱，主要是利用培养基中的糖作为碳源进行异养生长[25]。因此，普遍采用气密性小容器作为组培容器，进行传统的小型容器有糖培养[26]。试验结果表明，6.5 cm规格的培养瓶对金线莲的多糖的合成具有显著促进作用，9.0 cm规格的培养瓶，对金线莲多糖合成也有一定的促进作用，8.0 cm的瓶子规格则对金线莲多糖合成没有明显的促进作用。综合衡量培养基用量、接种数、污染率、培养架上摆放数等各方面因素，认为6.5 cm规格的培养瓶更有优势。容器内空气环境因子主要有光照、温度、湿度、CO2浓度、O2浓度、乙烯含量[27]。不同规格瓶子的瓶内空气、环境因子存在一定差异，对金线莲多糖物质的合成具有明显的影响，其具体影响机理目前还不清楚。因此在金线莲培养过程中，可以充分考虑使用合适大小的组培瓶，有利于提高金线莲产品的药用价值和保健价值。

综上所述，在MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+7 g/L琼脂+25 g/L蔗糖，pH 5.8，培养温度25±2 ℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d的同等条件下，使用直径为6.5 cm培养瓶，培养基中添加50 g/L香蕉泥，采用蓝光照射最有利于促进金线莲组培苗多糖含量的积累。

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