任氏液灌注时间对离体蟾蜍心脏功能的影响

崔娟

（南阳医学高等专科学校，河南南阳473000）

斯氏法离体蛙心灌注实验普遍用于人体生理学、病理生理学、药理学、运动生理学等实验教学中，是医学机能实验中常用的观察心脏活动的方法[1]。因离体蛙心不受神经、体液干扰，而在蛙静脉窦作用下自主兴奋，仍继续工作，故也是各研究单位观察药物、食物对心脏影响的重要方法。该实验成功与否容易受到诸多人为因素如蛙心脏血管分离结扎、蛙心套管液面保持等影响[2]。笔者发现，任氏液灌注时间长短对离体蟾蜍心脏功能的影响也颇为重要，但文献报道较少，为此我们进行了粗浅研究，现总结报告如下。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物中华蟾蜍50只，雌、雄兼有，体重（90．3±10．5）g，体长（10．6±1．4）cm，精神良好，由南阳医学高等专科学校实验动物中心提供。

1.1.2药品任氏液由机能实验室按标准配方[3]自行配置：NaCl 6．50 g，KCl 0．14 g，CaCl20．12 g，NaHCO30．20 g，NaH2PO40．01 g，葡萄糖1．0 g，加双蒸水至1 000 ml配制而成，所用试剂均为化学纯级试剂。

1.1.3仪器与试剂仪器：蛙类通用手术器械，刻度蛙心套管，双凹夹，铁支架，蛙心夹，肌张力换能器和BL－420型生物机能实验系统（四川成都泰盟科技有限公司），电子天平（上海医用激光仪器厂），贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）。试剂：肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2　方法

1.2.1离体蟾蜍心脏标本制备采用斯氏法蛙心插管[4]：取蟾蜍1只，用探针破坏脑和脊髓，仰卧位固定于蛙板上，充分暴露心脏，在左主动脉下穿一根线，距动脉圆锥2～3 mm处结扎，再从左、右两主动脉下方穿一根线，打一活结留作固定插管用。用眼科剪在动脉圆锥前端处向心脏方向剪一斜口，将盛有任氏液的蛙心插管由此口插入心室腔内，提起套管，连同近旁血管一起结扎固定，在结扎线远心端剪断周围组织，将心脏离体，随即用任氏液反复冲洗心室内余血，直至插管内灌流液完全澄清，然后保持套管内的液面高度约2．5 cm，画线标记，用双凹夹将蛙心套管固定于铁支架上备用。

1.2.2实验方法心肌收缩情况观察：用蛙心夹夹住心尖，另一端穿线，与肌张力换能器相连，换能器与BL－420型生物机能实验系统的通道1连接。心肌酶测定：观察心肌收缩情况后，立即剪取心尖部心肌组织用4℃蒸馏水反复冲洗，经滤纸吸干后称重，制成10%的心肌组织匀浆，4℃，3 500转/分离心10分钟，取上清液于－80℃的冰箱中保存[5]，500倍稀释液采用贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪测定LDH和CK的含量。

1.2.3分组方法将50只中华蟾蜍随机分为5组（A组、B组、C组、D组、E组），每组10只。蟾蜍心脏离体后，连通BL－420型生物机能实验系统，待心脏搏动稳定后，开始计时，截取0分钟、15分钟、30分钟、45分钟及60分钟时的收缩曲线，分别作为A组、B组、C组、D组及E组的心率、心肌收缩力的分析依据。

1.3　统计学处理

2　结果

2.1　任氏液灌注时间对离体蟾蜍心脏的心率、心肌收缩力、CK和LDH含量的影响（见表1）

由表1可以看出，任氏液灌注的不同时间，各组心率、心肌收缩力、CK和LDH含量比较，存在显著性差异（P＜0．01）。

表1　任氏液灌注时间对离体蟾蜍心脏的心率、心肌收缩力、CK和LDH含量的影响（±s）

表1　任氏液灌注时间对离体蟾蜍心脏的心率、心肌收缩力、CK和LDH含量的影响（±s）

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2.2　任氏液灌注不同时间不同观察指标两两比较的结果（见表2）

由表2可以看出，离体蟾蜍心脏用任氏液灌注0分钟、15分钟、30分钟时，其心率、心肌收缩力、CK和LDH含量比较，无显著性差异（P＞0．05）。而45分钟时，其各项指标与30分钟时相比，存在显著性差异（P＜0．05），显示已有心力衰竭迹象。60分钟时，心肌细胞内CK和LDH含量明显减少，故心率显著减慢，心肌收缩力严重降低，与45分钟时相比，存在显著性差异（P＜0．01），显示心力衰竭已经发生。故而离体蟾蜍心脏实验的观察一般应于30分钟内完成，最长不能超过45分钟，此结论与安红梅等[6]的研究有相似之处。超过45分钟，蟾蜍心脏已有心力衰竭的现象，对各种实验指标的观察皆有严重干扰。

3　讨论

心脏是血液循环的动力器官，离体蟾蜍心脏排除神经、体液因素对心功能的影响，可以从质和量上保证研究的准确性、科学性。为维持离体蟾蜍心脏正常营养及电解质供给而灌注任氏液，但灌注时间过长势必对离体蟾蜍心脏的心功能产生不利影响。肌酸激酶又称肌酸磷酸激酶，是参与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生的重要激酶，在骨骼肌、心肌中含量较多。乳酸脱氢酶是糖代谢产生能量过程中的重要糖酵解酶，心肌、骨骼肌和肾脏中含量最丰富。尽管蟾蜍心脏没有冠状动脉，耐缺氧能力较强，但心肌缺血缺氧时间过长也会导致能量代谢障碍，心肌不可逆损伤，心肌细胞内酶如CK和LDH外漏，致使心率减慢、心肌收缩力降低，诱发心力衰竭，因此，心肌细胞损伤程度可以通过测定心肌细胞内CK和LDH含量来衡量[7]。故本研究中任氏液灌注时间超过45分钟时，各项指标如心率、心肌收缩力、CK和LDH含量严重下降，此失真现象将会影响在离体蟾蜍心脏上各种研究的科学性、准确性。为提高离体蟾蜍心脏实验成功率，缩短离体时间，应注意以下几点：在开展观察前：（1）要熟悉蟾蜍心脏的解剖结构；（2）熟练掌握蟾蜍心脏离体手术步骤；（3）熟练掌握蛙心套管插入的方法和技巧；（4）能准确判定蛙心套管插入是否成功；（5）正确维护离体蟾蜍心脏。

综上所述，离体蟾蜍心脏灌注实验因其简单方便，直观性强，不受机体神经、体液等干扰，成为基础医学研究的重要方法，但蟾蜍心脏离体时间过长，将会对观察产生不利干扰。

表2　任氏液灌注不同时间不同观察指标两两比较的结果

参考文献：

[1]王玉中，孙素珍，蔡智慧，等．斯氏法、八木氏法制备离体蛙心灌流标本比较[J]．卫生职业教育，2008，26（1）：116－117．

[2]徐怡，汤剑清，刘少金，等．蛙心灌流实验中值得注意的几个问题[J]．数理医药学杂志，2002，15（5）：403－404．

[3]齐梁煜，黄月维，韦家河，等．王不留行醇提物和水提物对离体蛙心的影响[J]．现代预防医学，2016，43（10）：1873－1875．

[4]沈裕，杨琨，易蓓，等．生鱼胆汁对离体蟾蜍心脏功能的影响[J]．四川生理科学杂志，2013，35（1）：14－15．

[5]刘兵波，彭新，邱春復，等．不同糖浓度K－H液对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的影响[J]．赣南医学院学报，2009，29（2）：170－172．

[6]安红梅，红日木沙，郑倩，等．不同浓度没食子儿茶素没食子酸酯对离体蟾蜍心脏功能的影响[J]．四川生理科学杂志，2017，39（1）：11－12．

[7]马莉，蔡东联，黎怀星，等．红景天苷对疲劳小鼠氧化损伤的保护作用[J]．中西医结合学报，2009，7（3）：237－241．■