抑制高迁移率族蛋白A2对肾癌细胞侵袭转移能力的影响

叶志华　黄耿　桂定文

肾癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，其发病率在泌尿生殖系统中仅次于膀胱癌，位居第二[1]。肾透明细胞癌是肾癌病理分型中最常见的类型[2]。肾癌一般起病隐匿，早期无特异性症状，故而患者确诊时易出现局部浸润或向远处转移。近年来，肾癌的治疗方法日趋成熟，早期肿瘤经手术治疗后效果良好，但对已发生局部或远处转移的肿瘤在联合放化疗或免疫治疗后疗效仍不理想。因此,对肾癌侵袭和转移机制的分子水平研究仍有十分重要的意义。高迁移率族蛋白A2 (high mobility group proteins 2，HMGA2)是目前已在多个系统中证实与肿瘤发生发展密切相关的癌基因[3-4]，其在肾癌中的作用鲜有文献报道。本研究通过RNA干扰技术，抑制HMGA2 基因在肾癌细胞系786-O中的表达，观察并探讨其对786-O细胞侵袭转移能力的影响。

材料与方法

一、细胞培养及转染

人肾癌细胞系786-O购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。使用RPMI 1640培养液，内含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素。细胞于37 ℃，5% CO2培养箱内传代培养，换液间隔为2～3 d一次。于细胞对数生长期实验。siRNA由武汉bioscience公司设计并合成，序列为：正义链 5′-UCCGACUGCCCAAGGCACUUUCAAU-3′，反义链 5′-AUUGAAAGCCUUGGGCAGUCGGA-3′；阴性对照组(NC组)使用阴性对照 siRNA，序列为：正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反义链 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′，碱基顺序采用随机生成，与人类基因外显子无同源性。将5×105数量的786-O细胞接种于6孔板中，待细胞生长密度约80%左右时，使用lipofectamineTM2000转染试剂，按照试剂说明书进行转染。实验分为空白对照组(Ctrl组，未使用siRNA及转染试剂)、NC组(转染阴性对照siRNA)及siHMGA2组(转染HMGA2 siRNA)。

二、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)

HMGA2上、下游引物分别为5′-CACCTCATCTCCCGAAAGGT-3′、5′-GTTGGTTCTTGCTGCTGCTT-3′；内参-肌动蛋白(β-actin)上、下游引物分别为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTF-3′、5′-GGGCACGAAGGCTCATCATr-3′。于细胞转染48 h后，分别提取各组细胞总RNA，再反转录合成cDNA的第一链，反转录后PCR反应条件：92 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。分析结果以HMGA2与β-actin的灰度相对值表示。

三、Western免疫印迹

细胞转染 48 h 后，分别收集各组细胞，然后加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA 裂解液，裂解 30 min 后进行超声匀浆并提取细胞总蛋白。用 BCA 法检测总蛋白浓度后沸水浴变性蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳，再将凝胶置于电转槽中进行电转，最后凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5% 脱脂牛奶封闭 2 h后，分别加入相应一抗HMGA2 1∶200(ab97276; Abcam, Cambridge, UK)；钙粘蛋白E (E-Cadherin) 1∶500 (#14472, CST, USA)；波形蛋白(Vimentin) 1∶200(#5471, CST, USA)，4 ℃孵育过夜，同时以GAPDH为内参。室温下孵育膜 2 h，PBST 缓冲液洗膜 3 次，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗在室温下孵育膜 1 h，PBST 洗膜 3 次，暗室中滴加 ECL 底物显色，胶片记录阳性条带表达，后用gel pro 4.0 软件对胶片扫描的图像进行分析。以各目的蛋白与相应内参条带的灰度值比值进行统计学分析。

四、划痕实验

于细胞转染48 h后，使用无胎牛血清培养液培养24 h，用20 μl枪头形成划痕，洗去脱落细胞。显微镜下拍照并记录划痕宽度。培养箱培养24 h后再次显微镜下拍照并记录划痕宽度。依细胞愈合相对距离判断细胞运动能力。

五、Transwell细胞侵袭实验

Matrigel胶与无血清培养液按1∶8稀释后向Transwell小室内加入50 μl稀释过的Matrigel胶，于超净台中风干过夜。Transwell上室加入用无血清RPMI 1640培养液重悬的转染48 h后的786-O细胞200 μl (含5×104个细胞)，下室加入400 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。培养24 h后吸去室内液体，用棉棒擦去微孔膜上室面的细胞，多聚甲醛固定30 min，于37 ℃恒温箱中结晶紫染色30 min，PBS洗2次。在200倍光镜下随机选取5个视野进行观察，计数每个视野的细胞数目，以迁移细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的迁移能力。每组取其平均值，并进行统计分析。实验重复3次。

六、统计学方法

数据均以均数±标准差表示，应用SPSS 16．0统计软件分析，各组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、HMGA2 siRNA抑制786-O细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达

RT-PCR结果显示siHMGA2组HMGA2 mRNA水平较Ctrl组和NC组明显降低，Western免疫印迹结果提示siHMGA2组HMGA2蛋白表达较Ctrl组和NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

二、HMGA2 siRNA对786-O细胞上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响

Western免疫印迹结果显示siHMGA2组E-Cadherin水平较Ctrl组及NC组明显升高，Vimentin水平较Ctrl及NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。Ctrl组与NC组之间无显著差异(P>0.05)。以上结果表明siHMGA2可明显抑制786-O细胞EMT水平(图2)。

A：E-Cadherin；B：Vimentin

图1786-O细胞中HMGA2蛋白和mRNA的表达水平(与Ctrl组、NC组相比较*P<0.05)

A:E-Cadherin；B：Vimentin

图2HMGA2 siRNA对786-O细胞中EMT相关蛋白表达的影响(与Ctrl组、NC组比较*P<0.05)

三、抑制HMGA2对786-O细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示siHMGA2组细胞迁移能力较Ctrl组明显减弱，表明siHMGA2显著降低了786-O细胞的迁移能力(图3)。

图3Ctrl组及siHMGA2组786-O细胞的迁移能力

四、抑制HMGA2对786-O细胞侵袭能力的影响

Transwell细胞侵袭实验结果显示siHMGA2组细胞侵袭能力[(82.000±5.202)个]较Ctrl组[(202.000±3.610)个]、NC组[(189.000±6.433)个]明显减弱，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

A:Ctrl组；B：NC组；C：siHMGA2组

图4siHMGA2对不同组786-O细胞侵袭能力的影响(×200)

讨　　论

肾癌是泌尿生殖系统常见恶性肿瘤之一，因其起病隐匿，早期无特异性症状，患者初诊发现转移的比例约为30%[5]。肾癌的病理分型有透明细胞癌、嗜色细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌以及未分类肾细胞癌，其中透明细胞癌约占80%。肾癌的治疗方式目前以手术治疗为主，但患者术后复发率仍高约30%[6]。由于肾癌细胞对放疗及化疗均不敏感，深入研究肾癌发生发展过程中分子作用的机制可为肾癌的临床治疗提供新的基因靶点及治疗方式。

HMGA是一组存在于真核生物细胞核内，可与染色质结合的非组蛋白，包括HMGA、HMGB及HMGN三个家族，其中HMGA2属HMGA家族之一[7]。HMGA2包含3个AT-hook结构域和1个酸性C末端，其可通过AT-hook与DNA链结合导致DNA拉伸、弯曲或成环，故又被称为结构性转录因子[8]。HMGA2可通过调节多种基因的表达参与细胞增殖、分化及肿瘤形成等生理过程[3]。在甲状腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等肿瘤中均发现HMGA2的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关[9-12]。

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征[13]。肿瘤的侵袭和转移主要包含以下主要过程：肿瘤细胞的脱落、黏附、细胞外基质的降解、肿瘤细胞的移动以及血管形成[14]。其中肿瘤细胞的脱落与EMT密切相关。EMT是指上皮细胞转化为具有间质细胞表型的生物学过程，在肿瘤形成的过程中主要表现为：上皮细胞失去极性，细胞间的黏附和紧密连接减少，细胞获得游走迁移能力并逐渐转化为具有间质细胞形态和特性的细胞[15-16]。近年来已有多项研究表明，HMGA2异常表达增高对肿瘤EMT发生有明显的促进作用：Zhao等[17]研究发现HMGA2过表达可通过EMT通路促进舌癌转移；Wei等[18]研究报道上调HMGA2可促进子宫内膜癌细胞EMT发生；Xia等[19]研究证实HMGA2参与了鼻咽癌细胞EMT形成且HMGA2高表达提示患者预后不良。

本研究中，我们根据HMGA2的基因序列，设计并合成了siRNA-HMGA2，并经体外转染肾癌细胞系786-O获得了HMGA2敲除细胞系，通过检测EMT相关蛋白的表达水平及划痕实验，探讨抑制HMGA2对肾癌细胞侵袭和转移的影响。研究结果显示siHMGA2转染组细胞的HMGA2表达明显降低，迁移能力明显减弱，E-Cadherin表达明显升高而Vimentin表达明显降低，表明siHMGA2可明显降低786-O细胞的侵袭和转移能力。

本实验因条件限制，未能对HMGA2过表达情况下肾癌细胞EMT表型结果及侵袭转移能力进行比较研究，HMGA2调控肾癌细胞侵袭转移的分子信号通路有待后续研究补充。综上所述，抑制HMGA2 对肾癌细胞侵袭和转移能力有明显抑制作用，HMGA2具有作为预测肾癌发展及肾癌基因治疗靶标的潜能。

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