TYMS基因在前列腺癌细胞中的表达水平及其临床预后意义

宋章兴　崔应东　饶雪飞

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是中老年男性中第二常见的恶性肿瘤[1]。据报道，每10万人中就有128人罹患PCa，全球每年有110万新诊断的PCa，且每年有超过3万人死于PCa[1-3]。此外，随着人口的老年化和诊断技术的提高，PCa的发病率逐年上升[4]。虽然局限性PCa一般发展比较缓慢，但其容易发生远处转移，尤其是骨转移最为常见。有研究表明PCa的骨转移率高达90%，一旦PCa发生远处转移或骨转移，患者的临床预后则极差[5]。目前对于前列腺的相关检查手段主要包括直肠指诊、经直肠超声、血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)检测及前列腺穿刺活检[3,5-7]。直肠指诊和经直肠超声检查主要与检查者的经验有关，其主观性比较强；血清PSA检测虽然可以重复进行，但是PSA水平容易受到其他因素的影响，其特异性不高；前列腺穿刺活检属有创检查，且有一定的假阴性率。因此，亟待开发出新的检测手段，对于PCa的早期诊断和精准治疗具有重要的意义。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TYMS)在嘧啶代谢中发挥着重要作用，是DNA合成的关键酶[8]。有报道认为其与体内多种肿瘤细胞的增殖密切相关[9-12]，然而目前尚未有报道其与PCa的发病及进展之间的关系。因此，本研究通过分析TYMS基因表达与PCa的关系，以期为PCa的早期诊断和治疗提供参考。

对象与方法

一、研究材料及方法

GEO(gene expression omnibus)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库是由美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)建设并维护的基因表达谱储存数据库，截止2018年2月该数据库已经收集4 348 项数据集共2 397 211例样本的基因表达谱数据，我们从中下载4项独立的PCa基因表达数据集GSE32448[13]、GSE16560[14]、GSE17951[15-16]以及GSE79957[17]进行相关分析。GSE32448包含40例PCa患者的临床样本和40正常前列腺组织的临床样本，我们利用该数据集比较TYMS基因在PCa组织中和正常前列腺组织中的表达差异；GSE16560包含了281例PCa患者的基因表达数据，同时还附带对应PCa患者的临床病史特点数据(包括患者的发病年龄、Gleason评分及随访时间等)，我们利用该数据集分析TYMS基因表达高低与PCa患者的发病年龄及总生存期的相关性。GSE79957包含了260例PCa患者临床样本的基因表达数据，同样也包含比较详细的PCa患者临床病史数据(包括患者的发病年龄、TNM分期及PSA水平等)，我们利用该数据集分析TYMS基因表达与PCa患者TNM分期及血清PSA水平的相关性；GSE17951包含了154例PCa患者临床样本的基因表达数据，我们利用该数据集进行基于TYMS基因表达水平的基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)，以明确TYMS对PCa可能的作用机制。

二、统计学分析

TYMS在PCa和正常前列腺组织中的表达水平采用均数±标准差的形式呈现，并采用两独立样本t检验分析正常前列腺组织和PCa组织中TYMS基因表达差异。以TYMS在GSE16560和GSE79957中表达水平的中位数将PCa患者临床样本分为TYMS高表达组和TYMS低表达组。使用卡方检验分析TYMS高表达组和TYMS低表达组PCa患者临床病理特点的差异。采用Log-rank法对TYMS高表达组和TYMS低表达组PCa患者进行生存分析。以上所有统计分析采用SPSS 21.0软件完成，P<0.05作为差异具有统计学意义的判别依据。采用GraphPad 5.0作为绘图工具。此外，我们采用GSEA2-2.2.4[18-19]进行GSEA分析，以hallmark 基因集作为参考基因集，置换次数为1 000次，以P<0.05、错误发现率(false discovery rates, FDR)<0.25作为显著性富集的筛选依据。

结　　果

一、TYMS在正常前列腺组织和PCa组织中的表达情况

TYMS在GSE32448中所对应的探针为1554696_s_at。如图1所示，正常前列腺组织中TYMS的表达水平明显低于PCa组织中的表达水平[(16.04±9.54)vs(45.57±91.07)，P<0.044 8]。

图1正常前列腺组织和PCa组织中TYMS表达水平

二、TYMS表达与PCa患者临床病理相关性分析

为了进一步探讨TYMS表达水平与PCa的发病、进展之间的关系，我们分析了PCa患者的年龄、Gleason评分、TNM分期、血清PSA水平在TYMS高表达组和TYMS低表达组中的分布差异。如表1所示，TYMS高表达组和TYMS低表达组患者在年龄和血清PSA水平分布上无明显差异。TYMS低表达组中Gleason评分为6的患者数目明显高于TYMS高表达组(P<0.000 1)，TYMS高表达组中肿瘤分期T3的患者数明显多于TYMS低表达组(P=0.002)。

表1　TYMS基因表达水平与PCa患者临床病理特征的相关性

﹡TYMS高表达患者中有3例未报道患者TNM分期

三、TYMS对PCa患者预后的影响

为了进一步明确TYMS与PCa患者总生存期的关系，我们分析了GSE16560数据集中TYMS高表达组(n=140)和TYMS低表达组(n=141)患者的总生存期。如图2所示，TYMS低表达组PCa患者总生存期明显优于TYMS高表达组(P=0.005 6)。

四、基于TYMS基因高表达的GSEA分析

为了推测TYMS影响PCa患者临床预后可能的作用机制，我们以hallmark基因集为参考基因集，对TYMS进行GSEA分析，结果如表2所示，TYMS高表达组PCa样本主要富集了E2F信号通路、MYC通路、有丝分裂纺锤体、DNA修复、G2M检查点以及糖酵解等生物学过程，提示TYMS可能通过以上信号通路或分子生物学过程影响PCa细胞的增殖。

图2TYMS基因低表达组患者总生存期明显优于TYMS高表达组患者

表2　基于TYMS基因高表达组PCa样本的GSEA分析

讨　　论

PCa是欧美国家男性患者最为常见的恶性肿瘤，占男性患者癌症相关死亡的第二位[1]。虽然以PSA为基础的早期诊断明显改善了PCa患者的生存期，但是对于PCa过度诊断和过度治疗也随之上升，进而限制了血清PSA检测在临床上的应用价值[6-7]。另一方面，一旦PCa发生转移，患者的中位生存期则不到5年；去势抵抗的PCa患者的中位生存期则不到2年[3]。因此，寻找特异性更高的PCa早期诊断方法具有重要意义。

本研究表明，PCa组织中TYMS的表达水平明显高于正常前列腺组织中的表达水平。低表达TYMS的PCa患者Gleason评分和TNM分期明显优于高表达TYMS的PCa患者。同时低表达TYMS的PCa患者的总生存期明显优于高表达TYMS的PCa患者，提示TYMS与PCa患者的不良临床特点密切相关。此外，TYMS高表达组和TYMS低表达组患者血清PSA表达水平无明显差异，这可能与PSA检测的特异性不高有关。

有多篇研究报道TYMS基因能够影响体内多种肿瘤细胞的增殖。王明等[9]研究表明TYMS基因低表达与直肠癌患者近期疗效具有明显的相关性，TYMS低表达的直肠癌患者放疗敏感性更高。Weekes等[10]的研究表明携带有TYMS基因突变的胰腺癌患者化疗过程中不良反应更少。俞永康等[11]的研究表明ERCC1、TYMS、TUBB3、RRM1和TOP2A是影响食管鳞癌临床病理特征的部分关键基因。罗春英等[12]的研究表明低表达TYMS基因的非小细胞肺癌患者化疗反应更好、生存期更长。这些研究与我们的结论是相似的，即TYMS低表达的PCa患者临床病理特点更好，其生存期也更长。

GSEA分析结果表明，TYMS可能通过多种信号通路(E2F、MYC)、细胞周期(有丝分裂、G2M检查点)以及细胞代谢(糖酵解)等途径影响PCa细胞的增殖。

综上所述，TYMS在PCa患者中的表达水平明显高于正常前列腺组织，低表达TYMS的PCa患者在T分期、Gleason评分方面优于TYMS高表达的PCa患者，同时低表达TYMS基因的PCa患者总生存期长于高表达TYMS基因的PCa患者。以上结果提示TYMS可能是PCa患者独立的不良预后因素。

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