灵芝多糖液体发酵调控及药理作用研究进展

解修超， 贾少杰， 彭 浩， 邓百万*

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)

灵芝(Ganodermalucidum)又名红芝、木灵芝，隶属于多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma Karst)，作为珍贵的中药材在我国已有2000多年的历史。灵芝具有养心安神、止咳平喘、延年益寿的功效，对食欲不振、心悸、神疲乏力、高血压等疑难杂症均有显著疗效，是常用的滋补强壮、扶正固本的中药[1]。

目前，从灵芝子实体、菌丝体、孢子中分离多糖已达200余种。现代研究证实，灵芝多糖有抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤和降血糖等药理作用[2-4]。野外采集和人工栽培是获得灵芝的传统途径。野生灵芝极少，采集代价高昂；而人工栽培易受外界环境影响，导致灵芝品质参差不齐，且对自然环境和资源消耗巨大。近年来，液体发酵技术以其周期短、易操作、成本低等优点在植物、食品加工、大型食药用菌等领域广泛应用。液体发酵技术与发酵动力学相结合被认为是提高灵芝多糖的主要途径。

本文结合国内外对灵芝多糖的液体发酵调控及其药理作用的研究进展进行综述，旨在为灵芝多糖的合理开发和综合利用奠定基础。

1 灵芝多糖液体发酵调控

相比较液体发酵技术，灵芝传统椴木栽培和袋料栽培成本较高，对自然资源消耗和破坏极大。虽然有学者对椴木栽培和袋料栽培方式进行了改进和创新，但效果甚微。近年来，液体发酵技术以其易操作、周期短、成本低、产量大等优点迅速成为研究热点。采用液体深层发酵技术培养灵芝，可在短时间内制备大量优质菌种，可大大降低成本，有利于工业化生产，克服了灵芝栽培和野生灵芝采收的局限性。目前，对液体发酵技术研究集中在培养基和条件的优化、外源物质对代谢产物的影响和发酵动力学等方面。

1.1 灵芝液体发酵培养基的优化

培养基的优化是灵芝产业化生产的第一步，合适的液体发酵培养基可以使菌丝生物量成倍增长。培养基的优化包括对其组分的筛选和含量的研究，不同的碳氮源对菌丝生物量和多糖含量有影响。

1.1.1 碳源优化

碳源是机体生长所必须的元素之一，按照能否水解将其分为单糖、双糖和多糖。灵芝液体培养基中一般使用的碳源有葡糖糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉等，研究发现，不同的碳源对灵芝菌丝体的生长速度、形态及胞内多糖含量有很大影响。杨静静等[5]以添加不同质量分数的玉米粉作为碳源，研究其对灵芝液体发酵菌丝体和多糖的影响，结果表明玉米粉的质量分数在4%之内时，质量分数越大菌丝球的直径越小，有利于多糖的积累，同时不同质量分数的玉米粉对灵芝多糖的分子量大小无明显影响。于海洋等[6]研究了不同碳源对灵芝液体发酵菌丝生物量和胞外多糖的影响，以可溶性淀粉为唯一碳源时，生物量达到2.805 g/L，多糖达到0.909 g/L，菌丝对可溶性淀粉的利用率最高，蔗糖最低。此外，混合碳源以及碳源的质量分数对菌丝体和多糖合成也具有促进作用，不同比例的混合碳源可增加菌丝生物量。

1.1.2 氮源优化

真菌的生长离不开氮源，有机氮源在提供给真菌合成蛋白质等生命物质的同时还能提供一些微量元素，对多糖等代谢产物的合成也有促进作用。常见的有机氮源有豆饼粉、蛋白胨、酵母等，与无机氮源相比，真菌对有机氮源的吸收利用更高。冯杰等[7]在使用葡萄糖作为唯一碳源的情况下，研究了不同氮源对灵芝菌丝生物量的影响，使用添加量为3 g/L的酵母自溶粉为氮源时，菌丝生物量最高；以鱼粉蛋白胨为氮源时，生物量次之，但容易导致培养基细菌污染。此外，不同的氮源会使多糖的分子量有一定差异。碳源与氮源的不同比例(碳氮比)也会对灵芝液体发酵代谢产物产生影响，m(碳源)∶m(氮源)=(20～25)∶1是比较适宜的碳氮比。

1.1.3 无机盐

灵芝菌丝体的生长离不开镁、钾等无机盐离子。灵芝可以将对人体有益的无机态硒、锌元素富集和转化为人体更易吸收的有机态。不同的无机盐在灵芝菌丝体生长过程中作用不同。镁离子的缺少会导致灵芝代谢分子量较大的多糖，胞外多糖的产量与磷酸盐有关[8]。

1.2 液体发酵条件的研究

对液体发酵条件的研究主要集中在pH、时间、接种量、转速、溶氧量等方面。不同的食用菌最适pH不同，灵芝液体发酵培养基的pH一般在5～6.5之间。温度对机体酶促反应有极大影响，因此，温度对灵芝菌丝体生长和代谢物的积累至关重要，灵芝生长温度在27～30 ℃之间。Fang Q H[9]等探究了不同pH条件下对灵芝液体发酵代谢物产量的影响，结果表明，pH在3.5～7.0之间时，对菌丝生物量和代谢产物均有显著影响。灵芝液体发酵代谢产物随着发酵时间的增加先增加后减少，时间越长越不利于代谢物的积累。Chen Y L[10]等研究了发酵时间对灵芝液体发酵的影响，在不同的发酵时间段内，灵芝代谢产物会先增加后减少。此外，接种量也可以影响代谢产物的积累，采用保湿法可以明确灵芝发酵的最适接种量。接菌量过多不利于有机物的积累且增加耗氧量，接菌量过少会影响菌丝体的生长速率，使其速度过慢，发酵周期增长。

1.3 外源物质对液体发酵的影响

外源物质是指非机体内产生的有机物或无机物，包括金属离子、中药材提取物、生长因子、诱导剂等。研究表明，外源物质可增强机体的抗性，提高机体内有效成分的含量。近年来，外源物质不仅在植物萌发、代谢、抗逆性、生产等方面应用广泛，而且在大型真菌液体发酵中对代谢产物的影响方面起着重要作用。

1.3.1 金属离子在灵芝液体发酵中的应用

金属离子是灵芝菌丝体生长过程中不可或缺的物质，在液体发酵中发挥着重要作用。某些低质量浓度的金属离子可促进菌丝体生长，但质量浓度过高则会抑制其生长。不同的金属离子对其代谢产物影响不同，某些金属离子可阻碍灵芝代谢产物的产生。王诗然等[11]以产漆酶灵芝菌株为试验材料，通过低能N+束注入技术得到突变高产菌株，对其产生的漆酶性质进行了分析，金属离子Fe2+对漆酶活性的表达具有极强的阻碍作用，而Co2+和Cu2+对酶有明显的激活作用，Zn2+和Na+则对酶活性的影响不大。Ye S Q等[12]在灵芝液体发酵培养基中添加不同种类的金属离子，研究了其对代谢产物的影响，K+、Mg2+、Fe2+均可使灵芝菌丝体的生物量增加，当Fe2+的添加量为0.2%时，可提高灵芝多糖的含量。此外，稀土金属元素也可以影响灵芝发酵产物。Yao Q等[13]探讨了5种稀土元素La3+、Ce3+、Nd3+、Pr3+、Er3+对灵芝液体发酵中多糖产量的影响。添加一定质量浓度的稀土元素可明显提高灵芝液体发酵过程中多糖的代谢量。

1.3.2 中草药提取物在灵芝液体发酵中的应用

中草药提取物可提高液体发酵中代谢产物的积累。赵小瑞等[14]在灵芝发酵液中添加了4种中药材，研究了其对代谢产物的影响，4种中药材均对菌丝生长和代谢产物的积累有显著促进作用。双向发酵技术近年来也被运用于灵芝发酵中，辛燕花等[15]使用了银杏灵芝双向发酵技术探究了其对灵芝多糖的影响，双向发酵可以增加灵芝多糖的积累，并显著增强其抗氧化的能力。不同种类的中草药对发酵代谢产物影响不同。

1.3.3 诱导因子在灵芝液体发酵中的应用

液体发酵中除了一些必须的营养元素外，添加诱导因子如脂肪酸、水杨酸、木质素等可对代谢产物有显著影响。研究发现，脂肪酸可以促使某些真菌在液体发酵过程中产生并积累代谢产物。裴海生等[16]研究发现，在灵芝菌丝体生长过程中添加适量的木质素，可以显著提高生长速度，同时使多糖的含量增加。叶丽云等[17]以灵芝J-7和AL-2菌株为研究对象，在液体发酵中加入10 mmol/L钙离子诱导，多糖含量比对照提高34%。在发酵液中加入150 μmol/L水杨酸诱导，多糖含量提高57.54%。

1.4 灵芝发酵动力学研究

发酵动力学主要是研究液体发酵不同影响因子对代谢产物的影响作用。构建恰当的动力模型，可明显增加灵芝多糖的含量。一般情况下，将发酵动力模型分为细胞生长模型、产物合成模型和底物消耗模型三种。目前，已有模型被用于细胞生长动力学的描述，Logistic和Monod是现阶段最为常用的动力学方程。Monod方程一般不考虑由于菌丝体质量浓度增加而阻碍菌丝体生长的理论化简单模型。王国瑞等[18]以生物量和胞内多糖为主要指标对72株灵芝菌株的液体发酵进行了研究，并对其中3株高产菌株构建了发酵动力学模型。Lian R L等[19]采用DPS软件观察摇瓶和罐内分批发酵过程中灵芝的动力学特征。结果表明，构建的菌丝生长动力学模型与Logistic方程基本一致。采用发酵动力学结合液体发酵技术提取代谢产物制备前体物质。Bilal M等[20]在构建动力学模型后，从灵芝IBL-05中分离出锰过氧化物酶(Manganese peroxidase MnP)，通过硫酸铵沉淀和透析将粗MnP提取物纯化。使用戊二醛作为交联剂，将酶制剂包封在明胶基质上。最佳条件为：明胶20%(W/V)，戊二醛0.25%(V/V)，活化时间2 h，蛋白质量浓度0.6 mg/mL。明胶包封的MnP在pH 6.0、温度60 ℃呈现最大活性。Feng J等[21]对药用真菌灵芝液体深层发酵的胞外多糖动力学进行研究。在Logistic和Luedeking-Piret方程基础上，开发了动力学模型，通过Runge-Kutta遗传算法对模型的参数进行优化，所得的模型对灵芝液体深层发酵在工业生产中的应用是非常有用的。

2 灵芝多糖药理研究进展

目前，从灵芝中分离得到的灵芝多糖约有200种，一般多糖的分子量越大其药理活性越高，但也有研究发现，某些小分子量的多糖具有极强的药理作用。

2.1 抗氧化作用

灵芝多糖具有抗氧化的作用，其抗氧化能力强弱与多糖分子量的大小和质量浓度存在密切关系。张志军等[22]采用铁氰化钾还原法测定灵芝多糖的抗氧化能力，灵芝多糖具有抗氧化的作用和清除自由基的能力。Kan等[3]研究发现，在不同分子量的GLP80、GLP60、GLP40和GLP灵芝多糖中，GLP80抗氧化性最好。这表明灵芝多糖的分子量大小直接影响了其抗氧化能力的强弱。Utami W等[23]研究了灵芝乙醇提取物的还原能力，同时探究了对脂质过氧化的抑制作用。灵芝醇提物有抗氧化能力和抑制脂质过氧化作用，且均与质量浓度有关。乙酸乙酯分离物的还原能力与维生素E相当。同时，各分离物和维生素E对脂质过氧化的抑制作用没有显著差异。

2.2 免疫调节功能

灵芝多糖可以通过调节白细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的应激反应，对机体的免疫功能产生影响。Huang S Q等[24]通过给小鼠添加不同剂量的紫芝多糖来研究其对巨噬细胞信号转导的影响，在100 mg/(kg·d)时，可提高自然杀伤细胞活性。李文娟等[25]给小白鼠注射不同剂量的黑灵芝多糖，通过测定小白鼠T、B淋巴细胞和血清中IL-2与TNF-α含量等指标，分析对小白鼠免疫力强弱的影响。黑灵芝多糖可提高小白鼠免疫器官指数和T、B淋巴细胞数量，有效增强免疫功能。Carrieri R等[26]研究结果表明，灵芝提取的水溶性异聚糖具有改善免疫调节能力，异聚糖可以在炎症状中发挥保护作用，并对免疫反应受到抑制的人有益。

2.3 抗肿瘤作用

灵芝多糖分为α型和β型两种，前者一般不具有药理活性，而后者具有明显的药理活性。目前，灵芝多糖抗肿瘤的机理有阻碍肿瘤细胞分裂，促使其凋亡和增强机体免疫力两种途径。灵芝多糖可通过阻碍机体血管生长和降低细胞黏附度达到抗肿瘤作用。灵芝多糖可有效提高机体体液免疫和细胞免疫功能，阻碍肿瘤细胞的转移，减小其与正常细胞的黏附能力，进而使其凋亡。张晓春等[27]应用鸡胚尿囊膜(GAM)血管生成模型观察灵芝多糖对血管生成的作用。结果表明，灵芝多糖的添加量在0.2～5 μg之间时，可明显抑制GAM的血管生长，当质量浓度在0.33～33 g/L之间时，则呈现出正相关关系。最新研究表明，灵芝多糖(GLP)通过激活几种类型的突变型p53而表现出显著的抗癌活性。因此，GLP与其他化疗药物共同作用于突变型p53被认为是治疗癌症的新方法[28]。

2.4 其他作用

灵芝多糖在降血糖、抑菌等方面具有良好作用。灵芝多糖具有降低由链脲佐菌素(STZ)引起的糖尿病小鼠中血糖的作用。Li F等[29]将糖尿病小白鼠随机分为4组，测量小鼠的体重、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素和血脂水平。注射GLP治疗组的体重和血清胰岛素水平显著高于对照组，而FBG水平则有效降低。此外，灵芝多糖可有效降低胆固醇水平。GLP处理组的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平下降。GLP对于治疗与动脉硬化或高脂血症有关的糖尿病症将是一个很大的优势。Eo S K等[30]通过乙醇沉淀法和DEAE纤维素色谱柱从灵芝水溶性物质中分离出中性蛋白结合多糖(NPBP)和酸性蛋白结合多糖(APBP)两种蛋白质结合多糖。APBP表现出比NPBP更强的抗病毒活性，APBP的抗病毒活性与特异性糖蛋白的结合有关，并且APBP可阻碍病毒与细胞质膜的交互作用。此外，研究表明，灵芝多糖在降血脂、护肝等方面具有一定作用。

3 问题与展望

我国灵芝种质资源丰富，是灵芝资源合理开发和利用的基础，但灵芝资源开发不够深入，系统研究和实现商品化栽培的灵芝只有少数几种；灵芝多糖具有良好药理作用和巨大市场需求，有效成分应用研究一直是国内外热点。灵芝子实体生长缓慢，周期长，阻碍了其工业化生产的推广和应用。液体发酵是制备液体种的主要手段，更有利于多糖的提取；加入金属离子、中草药提取物及其他诱导因子等外源物质后，灵芝液体发酵的代谢物的产量得到提高，发展潜力巨大。但其中一些外源物质不适宜大规模工业化使用，且对技术要求较高。

目前，虽然已经有200余种多糖被分离，但对其结构、活性机理研究尚不明确，灵芝多糖成分分析还有待进一步加强。灵芝多糖分离研究不够系统，传统方式能耗高、效率低且提取过程中大量使用有机溶剂，影响多糖的产量和品质。现阶段我国灵芝种繁杂，栽培种问题更为突出，其多糖的活性均有差异，给多糖的活性研究带来一定阻力。这些问题都严重影响了灵芝多糖的开发和利用。因此，在灵芝多糖液体发酵、代谢途径、结构及抗性机理等方面的系统研究将为灵芝多糖的在医药领域的应用奠定基础。