大蒜素对大鼠冠状动脉微栓塞后心肌凋亡的影响

梁家宝　李浪　贺文慨

广西医科大学第一附属医院心脏病研究所（南宁 530021）

冠脉微栓塞（coronary microembolization，CME）是由于粥样斑块的损伤或破裂引起的一种病理现象，常常出现于急性冠脉综合征的患者中，也是经皮静脉支架术（percutaneous coronary intervention，PCI）的常见的并发症［1-2］。有研究［3］已经证明，CME能引发心功能障碍、恶性心律失常和心梗。同时现有的研究［4］表明，CME致心肌损伤使心肌凋亡增加。因此，抗凋亡被认为是减轻CME致心肌损伤的重要治疗手段。大蒜素主要来自于大蒜中，其主要成分为一种有机化合物——二烯丙基三硫化物（DATS）［5］。公认DATS可以用来预防和治疗多种疾病，目前多个研究［6］证实了其在抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病及抗氧化等方面的作用。但是DATS是否能够减轻CME所致的心肌凋亡以及相关机制仍未阐明。在本次研究中，首次发现大蒜素预处理能够减轻大鼠CME后的心肌细胞凋亡，并首次探讨了大蒜素预防CME致心肌凋亡的可能分子机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂42 μm微栓塞球冻干粉（2×107个/g）（挪威Dynal公司）；DATS（深圳Minn Bolin Biotechnology有限责任公司）；兔抗鼠Akt、兔抗鼠Caspase⁃3单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH单克隆抗体以及荧光山羊抗兔二抗（CST公司）；Trizol、逆转录试剂盒与实时定量PCR试剂盒（日本Takara公司）；cTnI ELISA试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及模型建立本研究于2016年12月开始，至2017年3月结束。首先取体重量200～250 g的成年SPF级SD大鼠共30只，雌雄不拘，随机分为单纯栓塞组（CME组）、大蒜素预处理组（DATS组）和假手术组（Sham组），每组各10只大鼠，购自广西医科大学实验动物中心。动物模型的建立参考自以往文献［7］，简而言之，首先腹腔注射（10%水合氯醛2.5 mL/kg）麻醉大鼠，经口迅速插入气管导管，将气管导管连接动物呼吸机，观察大鼠胸廓起伏，确保气管导管已正确插入气管。然后逐层开胸暴露心脏及大血管，血管钳夹紧主动脉根部，经注射器由心尖部迅速注射微球0.1 mL（3× 104个/mL）至左心室，同时夹闭主动脉10 s，呼吸、心率正常后逐层关胸，待恢复自主呼吸后拔脱导管。另以等量生理盐水替代微球行左室注射的10只大鼠为假手术组（Sham组）。DATS组术前连续 7 d 给予 DATS 40 mg/（kg·d）腹腔注射。术后所有动物常规注射青霉素预防感染，术后6 h超声检查结束后处死大鼠并取材。各组实验动物的体重和心率比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

1.2.2大鼠心功能的检测分别于术后6 h检测大鼠心功能（LVEF、CO、FS和LVEDd），使用S12探头，探头频率为12 MHz每只大鼠重复测量3次，取其平均值。所有超声检查均由同一位经验丰富的心脏超声科医生完成。

1.2.3切片制备检测心功能后，经腹腔注入5 mL 10%水合氯醛麻醉大鼠，立即开胸取出心脏，去除心耳、心房，将心室分为左室心肌部和右室心肌部。左室心肌部用液氮速冻后转入-80℃冰箱保存，用于实时定量PCR与Western blot；右室心肌部用4%多聚甲醛固定，固定12 h后再予石蜡包埋，而后切片。采用光学显微镜观察HE染色后CME后心肌细胞状态，并予TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。

1.2.4实时定量PCR定量测定Akt和Caspase⁃3的mRNA表达取左心室心肌组织200 mg，按照Trizol试剂盒操作说明书指示操作，提取总RNA，用Nanodrop测量其浓度，再按照Takara逆转录试剂盒操作说明，将RNA逆转录为cDNA；用SYB⁃RGREENI法检测PCR扩增产物。本实验的特异性引物均由日本Takara公司合成：Caspase⁃3：上游：5′⁃GCAGCAGCCTCAAATTGTTGAC⁃3′，下游：5′⁃TGCTCCGGCTCAAACCATC⁃3′；Akt：上游：5′⁃TC ATTGAGCGCACCTTCCAT ⁃3′，下游5′⁃TTCTGCAG⁃GACACGGTTCTC⁃3′；GAPDH：上游：5′⁃GAGATTA CTGCCCTGGCTCCTA⁃3′，下游：5′⁃CATCGTA⁃CT CCTGCTTGCTGAT-3′。反应条件：94 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环40次。

1.2.5TUNEL染色染色检测心肌细胞凋亡按试剂盒说明书操作，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞核发出绿色荧光，则为TUNEL阳性。随机选取共10个非重叠的200高倍镜视野，计算凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，使用凋亡率计算公式：心肌细胞凋亡率=调亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%算得心肌细胞凋亡率。

1.2.6Western blot检测Akt和 Caspase⁃3 表达取心室肌组织500 mg，放置于液氮中研磨，移至EP管中，加入蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液用BCA发检测蛋白浓度，将不同样本的蛋白浓度调至统一浓度5 μg/μL。配置10%分离胶和5%浓缩胶，每孔加样10 μL，聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流半干法转膜，用5%脱脂奶粉TBST缓冲液封闭1 h，分别置于Akt、Caspase⁃3的1∶1 000一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后用相应的1∶10 000荧光二抗孵育1 h；Odyssey荧光扫膜仪扫膜；最后，用ImageJ v1.36测量条带灰度值。

1.2.7ELISA检测cTnI水平取术后6 h大鼠的血清，静置30 min后5 000 r/min离心15 min，取其上清液并移至EP管中4℃保存，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠的cTnI水平。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0处理实验数据，计数资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD⁃t，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DATS对大鼠冠状动脉微栓塞心功能的影响与Sham组比较，CME组与DATS组LVEF、CO和FS显著下降，LVEDd显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CME组比较，DATS组LVEF、CO和FS显著上升，LVEDd显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠心功能比较Tab.1　Comparison of cardiac function of rats in each group±s

表1　各组大鼠心功能比较Tab.1　Comparison of cardiac function of rats in each group±s

注：与Sham比较，aP ＜0.05；与CME组比较，bP ＜0.05；LVEF：左心射血分数；FS：左心室短轴缩短分数；LVEDd：左室舒张末期内径；CO：心排出量

组别Sham组CME组DATS组LVEF（%）85.21±2.52 52.43±1.77a 71.44±3.20ab FS（%）40.32±2.56 35.25±3.20a 41.64±1.57ab LVEDd（mm）5.10±2.33 6.05±1.12a 5.18±1.87ab CO（L/min）0.164±0.005 0.102±0.003a 0.157±0.009ab

2.2HE染色结果HE染色显示微球周围心肌细胞核溶解或消失，周边细胞水肿、变性，周围炎性细胞浸润和红细胞渗出。见图1。

图1　CME组局部心肌微梗死灶（HE，×200），箭头示微球Fig.1　CME group of local myocardial micro⁃infarction（HE，× 200）and the arrow shows microspheres

2.3心肌细胞凋亡情况凋亡心肌细胞TUNEL染色细胞核发绿色荧光（TUNEL阳性），正常细胞核不发绿色荧光。Sham组、CME组及DATS组心肌细胞凋亡率分别为（0.36± 0.10）%、（8.77±2.03）%及（3.85±1.17）%。与Sham组相比，CME组与DATS组心肌细胞凋亡率明显增高（P＜0.05）；与CME组相比，DATS组心肌细胞凋亡率显著减小（P＜0.05）。见图2。

图2　各组大鼠心肌细胞凋亡（TUNEL）Fig.2　Apoptosis of rat cardiomyocytes（TUNEL）

2.4各组大鼠心肌Akt和Caspase⁃3 mRNA表达水平比较与Sham组比较，CME组与DATS组Akt mRNA表达水降低，Caspase⁃3 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CME组比较，DATS组Akt mRNA表达水平升高，Caspase⁃3 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠心肌Akt、Caspase⁃3 mRNA表达水平比较Tab.2　Comparison of expression levels of Akt and Caspase⁃3 mRNA in myocardium of rats in each group　±s

表2　各组大鼠心肌Akt、Caspase⁃3 mRNA表达水平比较Tab.2　Comparison of expression levels of Akt and Caspase⁃3 mRNA in myocardium of rats in each group　±s

注：与Sham组比较，aP＜0.05；与CME组比较，bP＜0.05

组别Sham组CME组DATS组只数10 10 10 Akt 0.79±0.07 0.24±0.03a 0.51±0.12ab Caspase⁃3 0.03±0.01 0.89±0.21a 0.60±0.08ab

2.5各组大鼠心肌Akt和Caspase⁃3蛋白表达水平比较与Sham组比较，CME组与DATS组Akt蛋白表达水降低，Caspase⁃3蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CME组比较，DATS组Akt蛋白表达水平升高，Caspase⁃3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、4。

2.6各组大鼠血清cTnI表达水平比较与Sham组比较，CME组与DATS组血清cTnI［（0.30 ± 0.015）μg/Lvs.（0.06± 0.002）μg/L］表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CME组比较，DATS组血清cTnI（0.20 ± 0.012 μg/L）表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

CME可见于急性冠脉综合征的患者中，也是PCI过程中常见的并发症。研究［8］表明，CME可引起短暂的“慢血流”或“无血流”，并可伴随着反应性充血和心肌收缩功能障碍的发生。CME被认为是急性心肌梗死患者远期预后不良和病死率的独立预测因素。

图3　各组大鼠心肌Caspase⁃3蛋白表达水平比较Fig.3　Comparison of expression of Caspase⁃3 protein in myocardium of rats in each group

图4　各组大鼠心肌Akt蛋白表达水平比较Fig.4　Comparison of Akt protein expression in myocardium of rats in each group

CME发生后，局部心肌会出现微梗死灶，心肌细胞会出现坏死和凋亡，心功能呈进行性下降［9］。已有研究［10］证明，凋亡是CME致心肌损伤中重要的病理过程，而抗凋亡治疗能够明显地改善大鼠心功能。在笔者的前期实验中，在6 h内CME后心肌凋亡达到高峰［11］。因此，本研究观察时间点选取为CME后6 h。

大蒜素是一种具有多种生物活性的二烯丙基三硫化物，是从大蒜中提取出来的复合物，已经用于治疗细菌感染、糖尿病和心血管疾病多年［12］。CHEN等［13］的研究发现，大蒜素能够保护乙醇所致的氧化应激，并且可以通过抑制凋亡因子Bax和上调抗凋亡因子Bcl2从而减轻硫化氢介导的凋亡。XU等［14］发现大蒜素能够清除神经细胞的氧自由基，并且通过激活Nrf2/HO⁃1通路抑制神经细胞的凋亡。在缺血再灌注方面，有研究发现大蒜素能够激活沉默信号调节因子1，从而减轻糖尿病小鼠的心肌缺血再灌注损伤［15］。本研究证实，与Sham组相比，CME 6 h后心肌细胞出现凋亡，心功能下降，与之相反的是，腹腔注射大蒜素则可显著改善心功能，同时减轻CME所致心肌细胞凋亡。因此，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤，这可能是大蒜素改善CME预后的重要机制之一。

Akt在抑制细胞凋亡中发挥着重要的作用［16］。磷酸化的Akt不仅能使糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，而丧失诱导细胞凋亡的作用；而且还能够抑制促凋亡相关蛋白Caspases的合成，进而发挥抑制细胞凋亡的作用［17］。Caspases家族的激活是凋亡过程中的不可或缺的重要步骤［18］。Caspases家族中的Caspase⁃3则是细胞凋亡蛋白酶级联的反应的必经步骤，同时是细胞凋亡的最重要的蛋白酶［19］。其中，Caspase⁃9 也是内质网应激所致凋亡途径中的关键蛋白，当内质网受到应激时，上游Caspase⁃9发生蛋白酶水解反应，激活下游Caspase⁃3，最终引起细胞的凋亡［20-21］。笔者在早期研究中发现，CME后Caspase⁃9介导的内质网凋亡途径显著激活，并参与CME后的心肌损伤［9］。大量研究证实，Caspase⁃3与心肌梗死密切相关，抑制Caspase⁃3的表达可以明显降低缺血所致的心肌凋亡和显著地改善心功能。本研究结果显示，与CME组比较，DATS组可显著抑制CME后内质网凋亡的激活，其主要的表现是激活Akt的磷酸化活性，减少Caspase⁃3蛋白的活化，心脏超声参数FS、CO、LVEF和LVEDd和心肌酶cTnI相比于CME组得到明显改善。提示大蒜素能够减少CME后的心肌细胞凋亡，改善心功能的作用，与Akt的激活有关。当然大蒜素减轻CME致心肌凋亡的更多的信号通路仍需要进一步实验研究完善。

综上所述，大蒜素预处理可明显减少CME后心肌细胞凋亡并改善心功能，其机制可能是通过激活Akt从而阻断心肌细胞Caspase⁃3介导的死亡受体凋亡途径的激活。PCI术前预防性应用大蒜素，可能可以改善患者预后。

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