cntf基因A/G多态性作为东北地区雪上技能主导类运动员早期选材的相关性研究

李　丽，周桐希

多年研究实践表明：运动成绩的取得与运动天赋和刻苦的训练密不可分，经过严格和刻苦的训练并不一定能取得优秀的运动成绩，其原因在于不同人带有不同遗传素质基因，也就是运动天赋不同.只有具有优秀运动基因的人经过科学训练才能获得优异成绩.纵观我国运动员选材的发展，主要为经验选材法［1］、形态学选材法、家族选材法、PTC尝味能力选材法、皮纹选材法、血型选材法及生理生化指标选材法.以上选材方法不能得出客观、准确的结论.

目前，分子生物学技术已得到广泛的应用，国内外学者在运动相关基因研究领域进行大量研究，已取得了有意义的成果.cntf（ciliary neuro⁃trophic factor）基因全称为睫状神经营养因子.cntf能够促进突触处神经分化，故神经发生损伤时能起到修复作用，即使神经元没发生损伤也能延缓其衰退［2］.Oppenheim RW［3］证实 cntf可维持运动神经元正常活动从而延缓其衰退；Anderson KD、Emerich DF和Emerich DF［4-6］实验证实外源性的cntf对被损伤的神经有修复作用.相关研究表明cntf基因多态性与力量素质相关.近年来对于cntf基因与运动能力的相关性研究较少，黄昌林等［7］通过对携带AG基因型和GG基因型的我国军人（男性、汉族）的握力测试，实验研究的结果显示此两种基因型的力量与体指数无统计学差异.韩伟等［8］对我国越野滑雪运动员cntf基因三种基因型与普通人进行实验研究得出的结论是无统计学差异.

基因选材是一种准确、客观、科学的选材依据，需要大量的实验数据支持.冰雪项目基因选材方面的工作现在还没有得到全面的开展，缺少运动项目、实验方面的数据支持.2022年冬奥会在我国举行，冬季项目选材和训练工作得到重视.此项目现在已经出现了一批具有世界水平的运动员，但后备人材的短缺制约着项目长期发展.利用当前优秀运动员的宝贵资源，对他们进行相关选材指标尤其是基因指标的测定，对于我国建立优秀运动员选材模型具有重要意义.本课题研究旨在对cntf基因能否作为雪上技能主导类运动员基因选材指标进行筛选，可为冰雪运动员的基因选材做前期积累工作.

1　研究对象与方法

1.1　研究对象

东北地区单板大跳台和坡式障碍优秀运动员为实验组，普通高校大学生为对照组.

实验组：东北地区单板大跳台和坡式障碍优秀运动员为实验组.测试对象：东北地区单板大跳台和坡式障碍优秀运动员21名（女11名、男子10名）.国际运动健将级别运动员2名，国家一级运动员5名，其余为国家二级运动员.平均运动年限7年，年龄在10～26岁.

对照组：选取参加全国高考的非体育专业考生，在高中阶段未参加过系统的体育训练，未曾经过体育术科考试，进入体院后没有进行专项训练.运动人体科学专业、体育人文专业本科生共115名.所有测试人员种族一致，年龄在16～23岁；调查表明本人无任何重大疾病，测试时保证身体健康.以上参加测试的人员均来自于中国北方汉族.

1.2　实验内容

采用分子生物学PCR-RFLP的方法对实验组和对照组的cntf基因A/G多态性进行测定.

1.3　主要实验仪器

PCR扩增仪（德国艾本德股份公司GSX1）；电泳仪（北京市六一仪器厂DYY-6D）；凝胶成像系统（美国Protein Simple公司Alphaimager Mini）.

1.4　实验操作主要过程

（1）全血DNA提取.静脉取新鲜全血5ml放入到带抗凝剂的试管中，按照普瑞麦格全血DNA摄取试剂盒操作.

（2）设计cntf基因的引物.查找Gene Bank数据库严格按照引物设计原则.依据Thome［9］等报道的cntf的引物序列和cntf基因多态位点的特点，利用Primer select 5.0软件来设计引物，提供给生物科技公司，由上海捷瑞公司合成，放在冰箱中保存.

（3）扩增cntf基因.扩增cntf基因的反应体系包括：Taq 酶 0.25μl、5×Taq Buffer 5μl、dNTP 0.5μl、灭菌双蒸水15.25μl、上下游引物各1μl、以及DNA模板2μl，共25μl.

（4）cntf基因 PCR扩增参数.95℃预变性5min；94℃变性5min35s、58℃退火30s、72℃延伸15s，共循环36次；72℃终末延伸8min；4℃保存.

（5）cntf基因A/G多态位点的酶切反应体系.cntf基因A/G多态位点的酶切反应体系包括：HaeⅢ限制性内切酶0.4μl、Buffer 0.2μl、BSA 0.1μl，以及扩增产物17.3μl，共18μl.

（6）电泳.依据所测得物质的分子量来确定浓度为：DNA由于分子量大确定浓度为0.8%；cntf基因经过酶切分子量浓度为3%.设置电泳仪器U=100V、P=50W、I=50mA，时间50min.电泳完毕后，观察凝胶采用紫外可见光分析装置，利用软件分析结果.

1.5　数据统计

（1）对照组和实验组的基因型频率分布运用基因平衡定律（Hardy-Weinberg，H-W）对其进行检验，确定所测人群的群体代表性，利用遗传学统计方法对三种基因不同多态性的频率和等位基因进行整理.

（2）用SPSS统计学软件对所得的数据进行统计，用卡方对基因型和等位基因频率进行检验，（P＜0.05）为显著差异，（P＜0.01）极其显著差异.

2　cntf基因A/G多态性的实验结果

（1）cntf基因A/G多态性的判断.睫状神经因子cntf基因保证鸡胚睫状神经元最初从鸡眼睛中提取.它是一个酸性蛋白质，具有200个残基的氨基酸，是一种细胞因子，属于白介素6家族.人的cntf基因定位第11号染色体长臂近端，由两个外显子和一个1kb左右内含子组成，本实验中HaeⅢ酶切多态位点位于第二个外显子和内含子之间，设计引物扩增后的长度为134bp，用HaeⅢ酶切后所得到产物G等位基因是40bp和94bp，A等位基因是134bp没有酶切位点，出现的三种基因型是AG、AA、GG.cntf基因A/G凝胶电泳图（见图1）.

图1　cntf基因A/G凝胶电泳图

Marker电泳条带：Lane 1为 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp.

纯合子AA电泳条带：Lane 4.

纯合子GG电泳条带：Lane 13、10、9、8、7、6、5、3、2.

杂合子AG电泳条带：Lane 12、11.

PCR产物电泳条带：Lane 14.

（2）cntf基因A/G多态性基因频率的平衡检验.由表1得出：经Hardy-Weinberg平衡定律的检验，实验组和对照组的HEW值为1.64和1.34.实验组和对照组基因型频率因（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡检验.结果显示，对照组和实验组cntf基因A/G多态性频率分布符合遗传定律.

表1　cntf基因A/G多态性频率分布的Hardy-Weinberg平衡定律的检验

（3）实验组和对照组cntf基因A/G多态性等位基因频率的检验.表2表明：无论实验组还是对照组的等位基因G频率都高于A频率，A等位基因实验组和对照组分别为14.3%和18.7%，G等位基因为85.7%和81.3%.经卡方检验实验组等位基因频率χ2=0.468，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.结论P=0.494（P＞0.05），无统计学差异.

表2　实验组和对照组cntf基因A/G多态性等位基因频率分布

（4）实验组和对照组cntf基因A/G多态性频率的卡方检验.据表3表明：实验组AA基因型频率为19.0%，AG基因型频率为4.8%，GG基因型频率为76.2%；对照组AA基因型频率为25.2%，AG基因型频率为6.1%，GG基因型频率为68.7%.经卡方检验实验组基因型频率χ2=0.474，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.结论P=0.789（P＞0.05），无统计学差异.cntf基因A/G多态性分布频率的顺序：①GG型，②AA型，③AG型.

表3　实验组和对照组cntf基因A/G多态性频率

3　分析与讨论

cntf基因能增加体内外大部分神经元的存活、阻止损伤后神经元的衰退、促进其恢复和影响神经元分化，增进运动神经元存活并具有保护作用［10］.这可能是cntf基因与力量素质有关的原因之一.Roth Stephen M通过对cntf多态性实验研究，结果表明，A/G型在进行快速运动时比G/G型产生的肌肉力量更大［11］.cntf基因能保持骨骼肌的形态和功能，增加肌纤维数目、减少由于缺少神经支配、衰老等原因而造成的肌萎缩、肌肉力量下降.它有营养肌肉的作用，cntf的受体存在于骨骼肌纤维中，两者的结合对骨骼肌纤维的生长有一定的促进作用，在促进长粗的同时通过对肌纤维的生长营养调控作用以提高肌肉的功能［12］.由于肌纤维营养充足，促进肌肉蛋白质合成使得肌纤维生理横断面积粗大，由于生理横断面积变粗、突触部位运动神经元和所支配的肌纤维的数量增加，从而促进肌肉力量的增长.研究显示：cntf对神经肌肉的病症可能有治疗作用，如早期阿尔茨海默病、帕金森氏综合症和重症肌无力［13］.实验表明，24个月的老年鼠坐骨神经cntf的表达量比6个月成年鼠低2～4倍，让其进行游泳训练，cntf的含量与游泳速度呈高度相关（P＜0.0003）.老年鼠比目鱼肌肌肉力量经过cntf处理14天后，肌力增加2.5倍（P＜0.001）.此研究证实：cntf基因与肌肉力量相关.

本实验结果显示：经Hardy-Weinberg平衡检验，对照组基因型频率P=1.34，实验组基因型频率P=1.64（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性.运动员组与对照组cntf基因的多态性中G等位基因分布频率普遍偏高，实验组基因型频率经卡方检验运动员基因型频率与对照组相比（P＞0.05）无统计学差异，此结果表明cntf基因A/G多态性，不可成为早期选材的指标，但研究结果显示运动员组G等位基因频率高.

分析其可能原因：实验组21个，全部为东北地区单板大跳台和坡式障碍优秀运动员，此两类项目属于技能主导类项群.虽为省级运动员，但全国此类项目优秀运动员全部集中于东北三省，尤其黑龙江省是雪上项目的强省.可以说，此21名运动员代表国家的水平.人数少是影响实验结果的主要因素.随着国家对冰雪项目越来越重视，在国家和地方政府的大力扶持下，运动员的人数会逐渐增多，在今后的研究中增加实验组的人数或通过增加同一项群实验人员的数量，再进行进一步研究以期得到客观的结论.

4　结论

经Hardy-Weinberg平衡定律的检验，对照组和实验组cntf基因A/G多态性频率分布符合遗传定律，具有群体代表性.

cntf基因A/G多态性，不可成为早期选材的指标，但研究结果显示运动员组G等位基因频率高.

通过研究了解我国技能主导类滑雪运动员运动相关基因多态性的分布，以单板大跳台和坡式障碍项目运动员基因选材为突破点，逐步开展我国冰雪运动员的基因选材工作，并在后备运动员选材过程中提供数据上的支持和选材标准，对此项目的长期发展具有参考作用.

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