蒿鳖养阴软坚方对刀豆球蛋白A诱导的肝纤维化Nrf2/HO-1信号通路影响

卢娜，方步武

（天津医科大学药理学系，天津300070）

肝纤维化是肝脏对持续性肝损伤的创伤再修复反应的病理产物，其病理特征主要表现为肝脏内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度异常沉积[1]。肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化甚至是肝癌的必经阶段，美国Friedman等[2]指出肝纤维化是一个可逆的过程，因而通过有效的抗肝纤维化治疗，早期的肝纤维化可以得到很好地逆转。氧化应激是肝纤维化发生的重要机制，Nrf2、HO-1蛋白是调节氧化应激的关键蛋白[3]。蒿鳖养阴软坚方（HYRP）是一种养阴活血软坚、凉血清热解毒的中药复方。本课题组以往研究发现，HYRP可以抑制肝星状细胞活化，降低肝细胞的炎症反应和氧化应激水平[4-5]。我国是乙肝大国，目前，多数学者认为乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关，免疫性肝损伤是多种急慢性肝病和继发的肝纤维化发生的共同病理基础，刀豆球蛋白A（ConA）诱导的小鼠急性肝损伤模型已被证实为以T淋巴细胞为主介导的免疫性肝损伤[6]。因此，本实验拟通过蒿鳖养阴软坚方对ConA诱导小鼠肝纤维化模型中肝脏组织病理及肝纤维化指标、Nrf2和HO-1蛋白的表达作用，探讨该方是否能够激活Nrf2/HO-1信号通路，降低肝纤维化水平，抑制免疫性肝损伤。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物Balb/c小鼠240只，SPF级，雌雄各半，体质量为18~22 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心。饲养过程中自由进食水和食物，室温20~22℃，适应环境3 d后用于实验。

1.1.2仪器设备CX31-12C04型光学显微镜（日本Olympus公司），VIS-7220紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），HZS-H型水浴振荡器，电热鼓风干燥箱。

1.1.3试剂蒿鳖养阴软坚方制备成原料药粉，用前配成混悬液；ConA、秋水仙碱和L-羟脯氨酸（Hyp）均为美国Sigma公司产品，批号分别为：C5275，C391，56250；乌来糖：上海润捷化学试剂有限公司；氯胺T：天津市化学试剂一厂，批号010708；高氯酸、对二甲氨基苯甲醛：天津市光复精细化工研究所；DAB显色试剂盒：博士德生物，批号AR1002；超敏二步法免疫组化检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-9001；Nrf2兔源多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-1074R；HO-1鼠源单克隆抗体：美国Santa Cruze公司，批号sc-390991；二甲苯、无水乙醇：天津市天新精细化工开发中心；过氧化氢、磷酸氢二钠、氯化钠：天津市江天化工技术有限公司；枸橼酸、磷酸二氢钠、三水醋酸钠、盐酸：天津市光复科技发展有限公司；异丙醇、柠檬酸三钠：天津市风船化学试剂科技有限公司；中性树脂：国药集团化学试剂有限公司，批号10004160；生物染色剂：Mayer苏木素染液、苏木精染液、伊红染液、天狼猩红-饱和苦味酸液、天青石蓝液。

1.2方法

1.2.1ConA模型制备及实验分组实验分为6组，即正常、模型、秋水仙碱（0.13 g/kg）和蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量（1.16 g/kg3、.36 g/kg、11.58 g/kg）组，ConA用量15 mg/kg，溶解于无菌无热源的0.9%NaCl生理盐水注射液中，配制成1.5mg/mL，经0.22μm微孔滤器过滤除菌。尾静脉注射10 μL/g ConA进行造模，每周1次，持续10周，末次注射后1周内处死小鼠。各组复制模型开始即同时经口灌胃相应药物，灌胃体积为0.1 mL/10 g体质量，正常组和模型组均经口灌胃相应体积的蒸馏水，每日1次，每周用药6 d至实验结束。

1.2.2标本采集末次用药24 h后，小鼠用乙醚麻醉，留取肝右叶组织（1.0 cm×1.0 cm）2块。一部分以10%福尔马林中性缓冲液固定后石蜡包埋切片；另一部分置于氯仿-甲醇脱水脱蜡液（V/V=2:1）中，每天换液1次，持续6 d，备测Hyp浓度。

1.3指标测定

1.3.1小鼠一般状态每日注意观察小鼠的精神状态、活动、进食量、体质量变化等情况。

1.3.2肝组织病理学观察常规石蜡切片做HE染色检查肝组织结构和Siriusred染色观察胶原纤维形成的情况。

1.3.3肝组织羟脯氨酸浓度测定采用Jamall氏法[7]。

1.3.4肝组织Nrf2、HO-1蛋白的表达情况采用免疫组化法，光镜下观察Nrf2、HO-1蛋白的表达情况。

1.4统计学分析利用SPSS 16.0软件分析处理数据，各项计量数据均以±s表示，两组间样本比较采用t检验，P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠一般情况及死亡情况正常组小鼠一般状态良好，皮毛柔顺有光泽，饮食量正常；模型组小鼠随着给药时间延长，活动量减少，精神萎靡，皮毛松弛无光泽，饮食量减少，体质量减轻；各治疗组小鼠一般状态明显好于ConA模型组，皮毛少光泽，体质量减轻。

2.2蒿鳖养阴软坚方对ConA模型小鼠肝组织病理学的影响HYRP对ConA模型小鼠肝组织形态的影响见图1；HYRP对ConA模型小鼠肝脏胶原纤维的影响见图2。

图1　HYRP对Con A诱导肝纤维化小鼠肝组织形态的影响（HE 染色，×200）Fig 1　Effect of HYRP on histological profiles of liver tissues in mice with hepatic fibrosis induced by ConA(HE staining×200)

图2　HYRP对ConA模型小鼠肝脏胶原纤维的影响（Siriusred染色，×500）Fig 2 Effect of HYRP on hepatic fibrosis induced by ConA(Siriusred staining,×500)

HE染色和Siriusred染色显示正常组小鼠肝细胞形态大小正常，肝小叶结构正常，无炎性细胞浸润，汇管区纤维组织无增生。模型组小鼠肝组织出现严重的损伤性病理改变，少数细胞肿胀及嗜酸性变，散在不同程度的小叶内坏死，有较多炎性细胞浸润，肝小叶结构紊乱，肝细胞索排列紊乱，汇管区纤维组织增生，并可见厚薄不一的纤维间隔形成。与模型组比较，蒿鳖养阴软坚方各剂量组和秋水仙碱组小鼠肝组织损伤性病理改变明显减轻，炎性细胞浸润和坏死减少，肝小叶结构接近正常，肝细胞索排列接近正常，汇管区纤维组织增生减少。

2.3蒿鳖养阴软坚方对ConA模型小鼠肝组织羟脯氨酸浓度的影响与正常组相比，模型组小鼠肝组织羟脯氨酸浓度显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组羟脯氨酸浓度均有不同程度的降低（P＜0.05）。结果见表 1。

表1　HYRP对ConA模型小鼠肝组织羟脯氨酸浓度的影响（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

表1　HYRP对ConA模型小鼠肝组织羟脯氨酸浓度的影响（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

实验分组n羟脯氨酸浓度/（μ g/m L）正常组　6　0.2 3±0.0 4模型组　1 0　0.7 0±0.3 5**蒿鳖养阴软坚方低剂量组　1 2　0.4 6±0.1 9蒿鳖养阴软坚方中剂量组　9　0.4 1±0.1 8#蒿鳖养阴软坚方高剂量组　6　0.3 7±0.1 5#秋水仙碱组　7　0.3 9±0.1 8#

2.4蒿鳖养阴软坚方对ConA模型小鼠肝组织Nrf2、HO-1蛋白表达的影响与模型组Nrf2细胞核内浅棕红着色比较，蒿鳖养阴软坚方各剂量组大部分细胞核内均呈较深棕红色着色，且随着药物浓度的升高，Nrf2在胞核内的表达逐渐增强，甚至出现棕褐色着色（图3）。与模型组HO-1细胞浆的微棕色着色比较，蒿鳖养阴软坚方各剂量组大部分细胞胞浆内均呈较深棕黄着色，且随着药物浓度的升高，HO-1在胞浆内的表达逐渐增强（图4）。

图3　HYRP对ConA模型小鼠肝组织Nrf2蛋白表达的影响（×40）Fig 3 Effect of HYRP on expression of Nrf2 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis（×40）

图4　HYRP对ConA模型小鼠肝组织HO-1蛋白表达的影响（×40）Fig 4 Effect of Haobie yangyin ruanjian prescription on expression of HO-1 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis

3　讨论

在肝纤维化发展过程中，多种信号转导通路的平衡被打破，多种促纤维化因子的合成增多、活性发生改变，而抗肝纤维化因子的作用减弱或受到抑制，最终导致细胞外基质代谢失衡而过度沉积，诱发肝纤维化的发生。

氧化应激是肝纤维化发生的重要机制。肝损伤时，细胞内活性氧（ROS）浓度显著升高破坏了机体的氧化/抗氧化系统平衡，诱导肝细胞释放大量的炎性细胞因子，进而活化肝星状细胞，加剧肝纤维化的演变。Nrf2属于Capncollar转录因子家族成员，具有亮氨酸拉链结构蛋白，可与细胞核内的小Maf蛋白形成异源二聚体，经乙酰化等结构修饰后实现其高活性状态，进而与抗氧化反应元件ARE结合启动下游II相解毒酶及抗氧化蛋白基因的转录[8]。HO-1是II相解毒酶中最容易被诱导的抗氧化酶，它能够将衰老或破损的红细胞释放的血红素降解为胆绿素、Fe2+和一氧化碳，而这3种催化产物对于维持细胞内氧化平衡均有重要的作用[9-11]。

本研究选择ConA作为诱导剂，建立小鼠自身免疫性肝纤维化动物模型。ConA诱导小鼠肝纤维化模型更适合用于研究人类自身免疫性肝病的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选[12]。研究结果显示，正常组小鼠肝小叶结构正常，模型组肝小叶结构紊乱，汇管区可见大量炎性细胞浸润，纤维组织增生，Nrf2、HO-1弱阳性表达，而与模型组相比，蒿鳖养阴软坚方治疗组大部分肝小叶结构接近正常，肝细胞索排列接近正常，汇管区有少量炎性细胞浸润，纤维组织增生减少，Nrf2、HO-1在细胞浆中的阳性表达明显升高，呈深棕色，且Nrf2在细胞核中也有阳性表达，呈剂量依赖性。

蒿鳖养阴软坚方为养阴活血软坚、凉血清热解毒中药复方，由青蒿、鳖甲、生地、丹参、虎杖、白花蛇舌草等9味中药组成，上述药物在慢性肝病（肝纤维化、肝硬化等）的临床治疗上使用频率较高、疗效好。前期研究表明，蒿鳖养阴软坚方对牛血清白蛋白、血吸虫病、酒精、CCl4复合因素所致的肝纤维化均有预防和治疗作用[4-5,13-16]。本次研究发现，蒿鳖养阴软坚方能够减轻ConA诱导的肝纤维化增生程度，降低肝组织中羟脯氨酸浓度，抑制炎症反应，诱导Nrf2和HO-1蛋白的表达。

综上所述，蒿鳖养阴软坚方具有改善ConA模型小鼠的临床症状和病理学变化及对抗免疫性肝损伤的作用，其机制可能与蒿鳖养阴软坚方能够激活Nrf2/HO-1信号通路有关，这为临床上治疗肝纤维化提供了新的思路。

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