新生期卡介苗和乙肝疫苗联合接种对哮喘小鼠IFN-γ、IL-4和IL-17A表达的影响*

沈雪艳，陈三妹，陈小萍，邢海燕，赵伟英，陈志华

(1绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000； 2浙江大学医学院附属第二医院呼吸和危重医学科，浙江 杭州310009)

支气管哮喘(简称哮喘，asthma)是儿童时期最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，全球约有3亿人口罹患哮喘，根据不同国家的不同诊断标准，患病率高达1%～18%，包括哮喘的儿童、成人以及喘息患儿[1]。支气管哮喘是以气道高反应性为主要特征的慢性变应性炎症性疾病，有嗜酸性粒细胞(eosinophils，EOS)、肥大细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞等多种细胞参与炎症反应。卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)是结核分枝杆菌减毒活疫苗，一种Th1型免疫反应刺激剂，具有治疗哮喘及其它过敏性疾病的潜在能力[2]。乙肝疫苗(hepatitis B vaccine，HepB)[3]接种是控制乙肝流行的有效措施。HepB常规接种中约5%～10%的人抗HepB阴性，属于无/低免疫应答人群。有研究发现HepB与BCG联用，BCG作为免疫佐剂能促进HepB无/低应答人群产生乙肝的保护性抗体[4-5]。我国自1992年启动乙型肝炎免疫项目，2002年将HepB纳入儿童常规免疫[6]，新生儿出生24～48 h内常规接种BCG和HepB两种疫苗。本研究通过观察新生期BCG和HepB联合接种对哮喘小鼠干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-17A表达的影响，探讨BCG和HepB联合干预对气道炎症的影响及可能的作用机制。

材　料　和　方　法

1　实验动物及材料

清洁级BALB/c小鼠(中国科学院上海动物中心，动物证书编号：X11C3152)，6～8周，体重18～22 g，2∶1比例雌雄交配，生产的幼鼠养至5周，选取48只供实验用，浙江大学医学部动物房饲养。卵清蛋白(ovalbumin，OVA； Sigma)；佐剂液态铝(PIERCE)；皮内注射用卡介苗(上海生物制品研究所)；重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母剂型带佐剂，深圳康泰生物制品股份有限公司)；IFN-γ、IL-4和IL-17A的ELISA试剂盒(R&D Systems)。超声波雾化器WH-2000型(广东粤华医疗器械厂)；ELISA检测酶标仪(Sigma)。

2　方法

2.1动物分组和模型制备将48只清洁级BALB/c小鼠按数字随机表法分为BCG和HepB联合接种造模(B/H/O)组、BCG接种造模(B/O)组、HepB接种造模(H/O)组、BCG和HepB联合接种(B/H)组、BCG组、HepB组、OVA模型组和生理盐水(normal saline，NS)对照组，共8组，每组6只。接种步骤为：B/H/O组和B/H组分别在第0、7和14天皮下注射BCG，每只1×105CFU，共3次，同时第0和28天下肢腿部肌肉注射HepB，每只1.5 μg，共2次；B/O组和BCG组分别在第0、7和14天皮下注射BCG，每只1×105CFU，共3次；H/O组和HepB组分别在第0和28天下肢腿部肌肉注射HepB，每只1.5 μg，共2次；OVA模型组和NS 对照组分别皮下注射0.05 mL NS。哮喘造模步骤为：第5周开始建立模型，B/H/O组、B/O组、H/O组和OVA模型组腹腔注射0.04% OVA (0.2 mL) 2次致敏，1.5% OVA雾化3 d激发，对照组用生理盐水致敏激发[2]。

2.2标本的采集和处理各组小鼠于末次OVA激发24 h后，摘眼球取血，收集血液于肝素钠抗凝的EP管内，4 ℃、2 000 r/min离心5 min，收集血清，-20 ℃保存备用。小鼠仰卧麻醉固定，暴露气管，插入改良的18G气管插管针。结扎右肺门根部，左肺行支气管肺泡灌洗，0.3 mL的PBS灌洗4次，回收灌洗液，回收率在80%以上，将回收的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)离心(20 ℃，2 000 r/min，10 min)，收集上清液，-20 ℃保存待检测因子，离心沉淀的细胞团用PBS缓冲液重悬至0.5 mL，取0.2 mL涂片，进行瑞特-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色，计算细胞总数和EOS数。取右肺组织，-80 ℃保存，肺组织匀浆待测因子。取左肺组织气管插管灌注4%多聚甲醛，使左肺膨胀(内固定)，后浸入4%多聚甲醛(外固定)，固定24 h后，取肺叶约2 mm，常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，蜡块切片用于HE染色。

2.3ELISA法检测细胞因子ELISA法检测参照试剂盒说明书进行，通过标准品吸光度(A)绘制标准曲线，然后计算各样本的值。检测血清中IFN-γ和IL-4的含量，计算IFN-γ/IL-4比值。肺组织匀浆，将右肺组织从-80 ℃取出，迅速称重取100 mg湿肺组织加1 mL PBS液，剪碎肺组织，放入电动匀浆器里匀浆，2 000 r/min，20～30 s，间隔数秒，重复3次，测肺组织匀浆中IL-17A的含量。

3　统计学处理

采用GraphPad Prism 5.01统计软件进行数据处理和统计分析。数据用均数±标准误(mean±SEM)表示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　肺组织的病理变化观察

HE染色结果显示，NS组、BCG组、HepB组和B/H组的气道上皮完整，纤毛排列整齐，杯状细胞少见，基底膜及平滑肌较薄，肺小血管内皮光滑，血管和气道周围见极少量炎症细胞，未见嗜酸性粒细胞。OVA模型组气道上皮细胞极度增生肥大，上皮不完整，纤毛排列紊乱，上皮下基底层增厚，平滑肌肥大增生，气道和血管周围及肺泡间隔内见大量的嗜酸性粒细胞和炎症细胞浸润。B/O组的气道上皮细胞增生肥大，上皮不完整，纤毛排列紊乱，上皮下基底层增厚，平滑肌肥大增生，气道和血管周围、肺泡间隔内见较少量的嗜酸性粒细胞和炎症细胞浸润。B/H/O组和H/O组的气道上皮细胞极度增生肥大，上皮不完整，纤毛排列紊乱，上皮下基底层增厚，平滑肌肥大增生，气道和血管周围、肺泡间隔内见极多量的嗜酸性粒细胞和其它炎症细胞浸润，见图1。

2　BALF中的细胞总数和EOS计数

与OVA模型组比较，B/H/O组、B/O组和H/O组BALF的细胞总数和EOS计数均下降(P<0.05)；EOS计数在B/H/O组高于B/H组(P<0.05)，B/O组高于BCG组(P<0.05)，H/O组高于HepB组(P<0.05)，见图2、3。

3　血清中细胞因子水平的检测

分别与B/H/O组、H/O组、OVA组和NS 对照组比较，B/H组和HepB组的IFN-γ水平均显著升高(P<0.05)，见图4。B/H/O组的IL-4水平显著下降，低于NS组和B/O组(P<0.05)，见图5。HepB组的IFN-γ/IL-4比值高于H/O组、OVA组和NS 组(P<0.05)；B/H组的IFN-γ/IL-4比值高于B/H/O组、B/O组、OVA组和NS 组(P<0.05)，见图6。

4　肺组织匀浆中的IL-17A水平的检测

与OVA模型组比较，B/H/O组和B/O组肺组织匀浆中IL-17水平均明显下降，H/O组无明显差异；与B/O组比较，B/H/O组IL-17水平进一步降低(P<0.05)，见图7。

讨　　论

BCG是结核分枝杆菌的减毒活疫苗，具有治疗哮喘及其它过敏性疾病的潜在能力[2]。哮喘是由Th2细胞和IgE介导的Ⅰ型变态反应性慢性气道疾病，其病理特点是嗜酸性粒细胞浸润的气道炎症[1]。BCG可诱导Th1型细胞免疫反应，促进IFN-γ和IL-12等细胞因子产生，促进巨噬细胞聚集活化，对致敏后已建立的Th2型细胞记忆反应也有抑制作用，可纠正哮喘中Th1/Th2的失衡。Shen等[2]研究证明，小鼠生命早期接种BCG可抑制OVA诱导的气道EOS炎症和气道高反应性。本研究显示，B/O组单独接种BCG使气道EOS浸润减少，利于缓解气道炎症反应，与前期实验结论一致。在HepB-BCG联合疫苗中，BCG具有抗原和佐剂的双重功能，即其既是卡介苗抗原组分，同时又是乙肝病毒表面抗原的免疫佐剂。Koike等[4]比较了BCG的细胞壁组分或其衍生物的佐剂效应，发现 BCG-CWS、TDM和MDP-lys这3种源于细菌衍生的佐剂能有效地增强HepB诱导的体液免疫和细胞免疫。姚红霞[5]临床研究90名HepB初种失败健康人群，对照组按HepB标准接种程序进行复种，观察组在3次接种HepB前各接种BCG 1次，接种后复查乙肝表面抗体，结果对照组复种成功率为42.2%，观察组复种成功率为93.3%，组间差异有统计学显著性。以上研究提示，HepB与BCG联用，BCG作为免疫佐剂能促进HepB无/低应答人群产生乙肝的保护性抗体[4-5]。

重组乙肝疫苗是一种免疫反应刺激原，它产生的单价成分不但能预防乙型肝炎，还能抵抗其它疾病，如白喉、小儿麻痹症、破伤风、百日咳和流感嗜血杆菌B感染等[3]。Moorman等[7]发现在HepB接种中CD4+T细胞反应是削弱的，跟PD-1信号途径有关。HepB-BCG联合疫苗诱导的细胞免疫主要表现是激活CD4+和CD8+细胞[4-5]。本研究发现，HepB/BCG联合或单独HepB接种时，血清Th2因子IL-4水平降低，IFN-γ/IL-4比值增高，影响Th1/Th2的比值，IL-4水平降低和Th1/Th2比值升高，减轻了气道的炎症反应，说明HepB/BCG联合接种减轻了气道的炎症反应。Deng等[8]研究发现，在野生型小鼠中，抗IFN-γ中和抗体阻断IFN-γ，提升BCG对抗哮喘的作用,外源性重组IFN-γ气道给药则加重气道的炎症反应。外源性IFN-γ对气道炎症的损害，依赖于Th1/Th2比例，过多剂量IFN-γ可导致气道炎症反应加重。

Figure 1.Pathological changes of the lung tissues (HE staining,×400).
图1肺组织病理变化的观察

Figure 2.The cell counts in BALF.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;△P<0.05vsBCG group;☆P<0.05vsHepB group.
图2BALF总细胞计数

Figure 3.EOS counts in BALF.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;#P<0.05vsB/H group;△P<0.05vsBCG group;☆P<0.05vsHepB group.
图3BALF中EOS计数

Figure 4.The serum level of IFN-γ.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/H group；#P<0.05vsHepB group.
图4血清中IFN-γ水平

Figure 5.The serum level of IL-4.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/O/H group；△P<0.05vsB/O group.
图5血清中的IL-4水平

Figure 6.The serum level of IFN-γ/IL-4.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;#P<0.05vsB/O group.
图6血清中IFN-γ/IL-4的比值

Figure 7.The level of IL-17A in the lung tissue homogenate.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/O/H group;△P<0.05vsB/O group.
图7肺组织匀浆中IL-17A的水平

有学者提出“非Th2型哮喘”，中性粒细胞参与哮喘的急性发病及恶化过程，其中IL-17起到重要作用。中重度哮喘患者的IL-17水平升高，IL-17的升高与中性粒细胞炎症有关，也与气道重塑有关[9-11]。IL-17A水平表达量下降，显示哮喘小鼠气道炎症程度较轻。Deng等[8]研究表明，IL-17基因敲除新生小鼠接种BCG能进一步减少OVA诱导的气道炎症和气道高反应性。本研究发现，与OVA模型组比较，HepB/BCG联合或单独BCG接种，IL-17A表达量明显下降，而单独接种HepB无IL-17A表达量下降现象；与B/O组相比，B/H/O组IL-17A水平明显降低，说明BCG接种能促进IL-17A的表达量下降，而HepB并不能改变IL-17A的表达量，HepB/BCG联合接种可进一步下调IL-17A表达量。

本研究发现，B/H/O组的肺血管周围炎症细胞大量增多，而气道周围较少，整体观察气道炎症反应是加重的。然而，BALF中的细胞总数和EOS计数在B/H/O组数量较OVA组减少，说明肺组织的气道部分炎症是减轻的，这与病理组织观察有矛盾。分析认为，在末次OVA激发24 h的时点处置小鼠，B/O组肺血管周围炎症细胞渗出较少，血管和气道周围的炎症已同步达到最高峰，因此BALF细胞总数和EOS计数与病理观察结果一致。然而，B/H/O组肺血管周围炎症细胞大量集聚，血管周围向气道周围渗出时间不够，尚未达到最高峰，所以B/H/O组的BALF细胞总数和EOS计数偏少，而病理观察肺组织血管周围炎症细胞增多明显，两者之间有差距。假设在末次OVA激发48 h的时点处置小鼠，炎症细胞渗出有更多的时间，血管周围与气道周围趋于一致，肺组织病理与BALF细胞总数和EOS计数之间会达到平衡，这个设想有待进一步实验证实。

另外，BCG和HepB同时接种的可行性、接种时点等有待进一步验证。考虑到反复接种某种抗原，可导致机体对于抗原表位扩展化识别，引发各种自身免疫性疾病，HepB和BCG在新生小鼠联合接种的不良反应需要谨慎。

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