右侧颈交感干离断对大鼠心肌梗死后炎症反应的抑制作用及对HMGB1/TLR4/NF-κB通路的影响*

何姗姗，余　娅，高　进，赖增燕，陈　萍

(重庆医科大学附属第一医院麻醉科，重庆 400016)

交感神经过度激活介导的促炎细胞因子释放以及神经内分泌的改变是影响心肌梗死后心室重构的重要因素[1-2]。许多学者提出，预防和逆转心室重构应该从抑制心肌梗死后自主神经的过度兴奋和神经内分泌的异常变化着手[3]。星状神经节阻滞(stellate ganglion block，SGB)对自主神经、心血管、免疫和内分泌等系统均有调节作用[4]，为SGB用于防治心肌梗死后心室重构奠定了理论基础。我们前期研究已证实右侧颈交感干离断(transection of cervical sympathetic trunk,TCST)能够抑制急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重构，保护心脏功能[5]，但其作用机制尚不清楚。

高迁移率族蛋白 1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白，其一旦从细胞核释放至细胞外，便可发挥炎症因子作用引起心肌损伤，同时HMGB1还可以促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素(interleukin,IL)-6等经典炎症因子的释放引发炎症级联反应，进而加重心肌损伤[6]。Giallauria等[7]发现HMGB1的释放与心肌梗死后自主神经功能紊乱有关。那么，星状神经节阻滞是否通过干预自主神经系统功能，进而调节HMGB1的释放而实现心脏保护作用呢？本研究拟通过右侧颈交感干离断模拟人星状神经节阻滞[8]，观察右侧颈交感干离断对心肌梗死后HMGB1的表达及炎症反应的影响，并探讨其可能机制，为临床应用提供理论依据和实验基础。

材　料　和　方　法

1　实验动物与试剂

SPF级成年雄性SD大鼠88只，体质量250～280 g，由重庆医科大学实验动物中心提供 [合格证号为SCXK(渝)2012-0001]。抗HMGB1抗体(Abcam)；抗TLR4抗体(Santa Cruz)；抗髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)抗体(Immumoway)；抗NF-κB p65抗体(CST)；抗GAPDH抗体(Proteintec)；抗LaminB抗体(万类生物科技)；Trizol试剂、Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq酶(TaKaRa)。

2　方法

2.1模型制备及分组本实验采用结扎左冠状动脉前降支制备AMI模型。腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉大鼠，气管插管行机械通气，于大鼠胸骨左侧旁0.5～1 cm切开第3、4肋间，暴露心脏并分离心包膜，在左心耳与肺动脉圆锥交界稍下方3～4 mm处以6-0无损伤缝线结扎左冠状动脉前降支，肉眼观察到前降支供血区变苍白或发绀，心电图出现肢体Ⅱ导联ST段抬高，则AMI模型建立成功，然后挤压两侧胸廓排出空气并逐层关闭胸腔，自主呼吸恢复后拔出气管导管。

TCST模型制备：切开颈正中皮肤，分离皮下组织和肌层，暴露右颈总动脉，在其分叉处的后方找到颈上神经节，于其下3 mm处离断颈交感神经干，缝合切口，待大鼠苏醒后，观察右眼出现Horner综合征，即上睑下垂、眼裂变窄和瞳孔缩小，则右TCST模型制备成功。

88只雄性SD大鼠，随机分为假手术(sham)组、心肌梗死(MI)组和右侧颈交感干离断(MI+TCST)组，MI组和MI+TCST组分别按照模型制备和干预后不同时点再分为1、3、7、14和28 d 5个亚组，每组8只。Sham组只穿线不结扎左冠状动脉前降支；MI组结扎左冠状动脉前降支，仅分离右颈交感神经干，不离断；MI+TCST组左冠状动脉前降支结扎后立即行右侧颈交感干离断。

2.2心功能检测用超声心动图检测大鼠心脏功能。术后28 d大鼠称重，3.5%水合氯醛麻醉后左侧卧位固定，备皮，选用RMV-716探头(频率17.5 Hz)测量大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastole dimension,LVEDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systole dimension,LVESd)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短分数(left ventricular shorterning fraction,LVFS)，测量3个心动周期，取平均值。

超声检测结束后，处死大鼠，迅速开胸切取心脏，分离心房和大血管，沿室间隔分离左心室(包括室间隔)和右心室，用冰生理盐水冲洗干净并吸干水分后分别称取左、右心室重量。计算心脏肥厚指数：心脏重量/体质量(heart weight/body weight，HW/BW；mg/g)、左心室重量/体质量(left ventricular weight/body weight，LVW/BW； mg/g)、右心室重量/体质量(right ventricular weight/body weight，RVW/BW； mg/g)和左心室重量/心脏重量(LVW/HW; g/g)。

2.3心肌组织病理形态变化各组大鼠心肌组织经4%多聚甲醛固定后，常规梯度乙醇脱水、石蜡包埋，4 μm连续切片。常规HE染色，光镜下观察梗死区、交界区和非梗死区心肌组织病理形态变化。

2.4Real-time PCR检测HMGB1、TNF-α及IL-6 的mRNA表达取梗死周围区心肌组织，置于液氮中保存，Trizol法提取心肌组织总RNA，检测RNA浓度和纯度后，按照试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA并保存于-20 ℃冰箱。采用SYBR Green荧光染料法，按照试剂盒说明书进行real-time PCR反应。设定GAPDH为内参照基因，上游引物为5’-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3’，下游引物为5’-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3’；HMGB1的上游引物为5’-AAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAG-3’，下游引物为5’-CTAGTTTCTTCGCAACATCACCA-3’；TNF-α的上游引物为5’-TGAACTTCGGGGTGATCGGT-3’，下游引物为5’-GGCTACGGGCTTGTCACTCG-3’；IL-6的上游引物为5’-GATTGTATGAACAGCGATGATGC-3’，下游引物为5’-AGAAACGGAACTCCAGAA-GACC-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

2.5Western blot法检测蛋白表达取适量心肌组织，用干净眼科剪剪碎并按比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆后冰上裂解0.5 h，之后分别采用总蛋白提取试剂盒和核蛋白提取试剂盒提取心脏组织蛋白。总蛋白用于检测HMGB1、TLR4和MyD88的蛋白表达水平，而核蛋白用于检测NF-κB p65的蛋白表达水平。BCA法检测蛋白浓度后，等量蛋白样本电泳并电转至PVDF 膜上。用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，滴加相应的 I 抗(抗HMGB1抗体，1∶10 000； 抗TLR4抗体，1∶500； 抗MyD88抗体,1∶1 000；抗NF-κB p65抗体，1∶1 000； 抗GAPDH抗体，1∶500； 抗LaminB抗体，1∶500)，4 ℃孵育过夜。洗膜后，滴加II抗，37 ℃孵育1 h，再经洗膜后于暗室中行ECL显影曝光，并用Fusion软件分析条带灰度值。核蛋白NF-κB p65蛋白表达水平以NF-κB p65灰度值/LaminB灰度值表示，总蛋白蛋白表达水平以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示。

3　统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　心功能的变化

与sham组比较，MI组LVEDd和LVESd显著升高(P<0.05)，而LVEF和LVFS显著降低(P<0.05)；与MI组比较，MI+TCST组LVEDd和LVESd显著降低(P<0.05)，而LVEF和LVFS显著升高(P<0.05)，见图1、表1。

Figure 1.M-mode echocardiograms obtained with two-dimensional guidance from a short-axis midventricular view from rats of all groups.A:sham operation group; B:MI group; C:MI+TCST group.
图1各组大鼠M型超声心动图

表1AMI后第28天大鼠超声心动图结果比较
Table 1.Comparison of echocardiographic results in rats on 28 d after AMI (Mean±SD.n=8)

GroupLVEDd(mm)LVESd(mm)LVEF(%)LVFS(%)Sham6．06±0．433．41±0．3382．50±3．0748．63±2．39MI8．41±0．39∗7．05±0．48∗43．37±6．99∗12．00±2．00∗MI+TCST7．16±0．24∗#5．59±0．35∗#65．00±3．54∗#24．00±4．14∗#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMI group.

2　心脏肥厚指数的变化

与sham组比较，MI组的HW/BW、LVW/BW和LVW/HW均显著升高(P<0.05)；与MI组比较，MI+TCST组的HW/BW、LVW/BW和LVW/HW均显著降低(P<0.05)。各组在RVW/BW方面差异无统计学显著性，见表2。

3　HE染色观察心肌组织病理形态变化

Sham组心肌细胞排列整齐，横纹清晰，示正常心肌细胞形态，可见少量炎症细胞浸润；MI组梗死周边区心肌细胞肿胀，形态不规则，细胞核大而深染，炎症细胞浸润明显，细胞间隙可见大量增生纤维组织，心肌纤维增粗、变长、排列紊乱、间隙增宽，横纹消失；MI+TCST组心肌细胞稍肿胀，排列稍紊乱,细胞间隙仍有纤维组织，但较MI组心肌组织结构破坏明显减轻，炎症细胞浸润减少,见图2。

表2AMI后第28天大鼠心脏肥厚指数的比较
Table 2.Comparison of cardiac hypertrophy index in rats on 28 d after AMI (Mean±SD.n=8)

GroupHW/BW(mg/g)LVW/BW(mg/g)RVW/BW(mg/g)LVW/HW(g/g)Sham2．34±0．071．81±0．060．53±0．020．77±0．01MI2．84±0．06∗2．30±0．05∗0．53±0．030．81±0．01∗MI+TCST2．56±0．04∗#2．03±0．03∗#0．53±0．020．79±0．01∗#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMI group.

Figure 2.Pathological sections of HE staining in cardiac tissue of rats of all groups (×400).A:sham group; B:MI group; C:MI+TCST group.
图2各组大鼠心肌组织HE染色结果

4　心肌组织HMGB1、TNF-α及IL-6的mRNA表达情况

与sham组比较，MI后1 d心肌组织早期炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达上调，3 d达最高，7 d后开始下降，28 d仍明显高于sham组(P<0.05)；晚期炎症因子HMGB1的mRNA在MI后3 d表达上调，7 d达最高，之后开始下降，28 d仍明显高于sham组(P<0.05)。与MI组比较，MI+TCST组各对应时间点亚组中心肌组织HMGB1、TNF-α和IL-6的mRNA表达均有所下调，28 d后IL-6的mRNA水平与sham组间无显著差异,见图3。

Figure 3.The mRNA expression of HMGB1,TNF-α and IL-6 in the cardial tissues in different time points after AMI.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMI group.
图3AMI后各时段心肌组织HMGB1、TNF-α和IL-6的mRNA水平

5　AMI后不同时点心肌组织HMGB1和TLR4的蛋白表达变化

与sham组比较，MI后3 d HMGB1蛋白表达增加，并于梗死后7 d达到高峰，之后开始下降，28 d仍明显高于sham组(P<0.05)；TLR4蛋白的表达变化与HMGB1一致,见图4。

Figure 4.The protein expression of cardiac HMGB1 and TLR4 at different time points after AMI.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group.
图4AMI后不同时点心肌组织HMGB1和TLR4蛋白表达的变化

6　TCST对心肌组织HMGB1和TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与sham组比较，心肌梗死后7 d心肌组织中HMGB1、TLR-4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与MI组比较，MI+TCST组HMGB1、TLR-4、MyD88和NF-κBp65 蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),见图5。

Figure 5.The protein expression of HMGB1,TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in the cardiac tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMI group.
图5各组大鼠心肌组织HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达比较

讨　　论

炎症反应是心肌梗死后机体的内源性应激反应，心肌梗死后早期适度的炎症反应能够对存活的心肌细胞产生保护作用，有利于梗死后心肌愈合、对抗心肌扩张以及增加梗死后心肌瘢痕的抗拉伸强度，而过度持续的炎症反应在心室重构的发展中起着重要作用[9]。因此，对MI后炎症反应进行调控是临床和科研工作的重点。

本实验通过建立大鼠急性心肌梗死模型以及右侧颈交感干离断干预，研究右侧颈交感干离断对MI后炎症反应的调控及对心室重塑的改善。研究发现，右侧颈交感干离断能够提高MI后心脏功能，降低心脏肥厚指数，与我们前期研究结果一致。Chen等[10]也发现右侧星状神经节阻滞除能够降低自发性高血压大鼠的血压外，更重要的是降低心脏肥厚指数，逆转心肌肥厚和纤维化。大量研究证实炎症因子，如TNF-α和IL-6等参与了心室重构的发生发展，心肌梗死后TNF-α表达上调，促进心肌成纤维细胞增殖及胶原纤维分泌增加[11]，诱导心肌细胞凋亡[12]，加重心肌肥厚并导致心室重构；IL-6在心肌梗死后表达亦升高，介导大鼠心肌纤维化、左心室向心性肥厚和舒张功能障碍[13]。本实验进一步研究发现右侧颈交感干离断可降低心肌梗死后不同时段HMGB1、TNF-α和IL-6的mRNA水平，而且在MI后第28天，IL-6的mRNA水平与sham组间的差异无统计学显著性，提示右侧颈交感干离断可能通过抑制炎症因子的表达来减轻炎症反应，以免过度持续的炎症反应导致不良的心室重构。

HMGB1作为一种新型促炎因子，参与MI后炎症反应已得到大量的研究证实[6,14]。它不仅可以作为炎症因子，还可以作为促炎因子上调引起其它炎症因子如TNF-α和IL-6的表达，引发炎性瀑布反应[6]。注射中和性抗HMGB1抗体可以降低心肌梗死后炎症反应[14]。本研究也同样证实了这一点，MI后心肌组织HMGB1的表达明显升高，并伴随TNF-α和IL-6水平的升高，而右侧颈交感干离断可明显降低心肌组织HMGB1的表达,减轻炎症反应。说明右侧颈交感干离断可通过抑制HMGB1的表达，减轻心肌梗死后炎症反应。但右侧TCST具体通过什么机制抑制HMGB1的表达尚未见报道。有研究发现，星状神经节阻滞能防治缺血引起的交感神经反射,改善冠脉血管床的张力,提高心肌边缘区的冠脉灌注,减轻心肌损伤[15]，这可能是右侧TCST抑制心肌HMGB1的释放，减轻其引起炎症瀑布反应的重要机制。另有研究表明，SGB可以降低交感神经活性从而使迷走神经相对兴奋，通过“乙酰胆碱抗炎通路”抑制炎症因子的释放[16]。临床研究发现[17]SGB可降低严重创伤患者早期促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，减轻全身炎症反应综合征；蔡可庆[18]发现SGB不仅可降低脓毒症大鼠早期炎症因子的水平，还可降低晚期炎症因子HMGB1的水平，与本研究结果相似。这可能是TCST抑制MI后HMGB1表达的又一机制。

研究证实[19]，HMGB1发挥细胞外促炎因子作用主要是通过与晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)和Toll样受体(toll-like family of receptors，TLRs)等受体结合。另有研究显示[20]，心肌缺血再灌注过程主要是通过HMGB1/TLR4引起炎症反应。本研究显示HMGB1蛋白的表达水平在心肌梗死后3 d开始升高，7 d达到高峰，之后开始下降，MI后28 d仍明显高于sham组，与已有文献报道一致[14]。TLR4蛋白与HMGB1蛋白的表达变化一致，这也提示TLR4可能是HMGB1发挥促炎作用的主要受体。大量证据表明，TLR4-NF-κB-前炎症因子信号转导通路是AMI后炎症反应的关键途径之一[21]；抑制NF-κB的活化可以减少大量炎症因子的表达，减轻炎症反应，改善大鼠心肌梗死后心室重构[22]。本实验结果发现，与sham组比较，MI后心肌组织中TLR-4、MyD88和NF-κB p65蛋白含量明显升高，并且与HMGB1的表达变化一致，说明TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路参与了MI后HMGB1介导的炎症反应过程。当受到缺血缺氧刺激时，损伤坏死的心肌组织释放大量的HMGB1蛋白，细胞外的HMGBl通过与细胞膜上的TLR4受体结合，激活膜内表面的依赖性MyD88，进一步导致NF-κB的过度活化，从而引起炎症因子IL-6和TNF-α等的大量释放[23]，而以上促炎因子又可以反过来促进HMGB1的表达，形成恶性循环，导致炎症反应的放大和持续。而右侧颈交感干离断可减少心肌组织TLR-4、MyD88和NF-κB p65蛋白的含量，并且与对HMGB1蛋白表达的影响一致。因此，我们推测右侧颈交感干离断可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用。

综上所述，右侧颈交感干离断能够提高MI后心脏功能，降低心脏肥厚指数，可能与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路被抑制，炎症反应减轻有关。

(致谢：本实验主要在重庆医科大学动物实验中心和重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成，感谢各位老师和同学对本实验的帮助和指导!)

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