牵张应力刺激介导间充质干细胞的信使RNA和长链非编码RNA表达谱变化

邹庆宝 靳松 黄爱军

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是人体内重要的多能干细胞，广泛存在与骨髓、脂肪和肌腱止点等结缔组织中，除了具有支持造血干细胞的作用外，还具有对免疫系统多种细胞的抑制能力[1]。除此之外，MSC还具有强大的多向分化能力，可以在不同条件下分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[2]。新近研究显示，人体内的成骨细胞主要由MSC分化而来[3]。由于具有体外易于扩增、免疫原性低的特点，近年来MSC已在组织修复重建、生物医学工程中广泛使用，具有良好的临床应用前景[4]。

机械应力，特别是牵张应力，是影响人体内骨骼形成与发育的关键原因之一，是维持骨组织应力平衡的重要因素[5]。近年来，许多研究已经证实牵张应力可以通过改变MSC基因表达谱以影响其成骨分化能力，从而参与调控机体内的骨修复与重建平衡，但目前机制尚未完全阐明[6]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lnc- RNA）是一种长度大于200 nt、不具备编码蛋白质能力的RNA片段。既往认为，非编码RNA只是细胞转录过程中出现的无用物质，然而新近的研究却显示lnc-RNA可以通过多种方式，参与细胞中各种功能的调控[7]。已有研究发现，lnc-RNA可以参与MSC成骨分化的调控，但lnc-RNA是否参与了牵张应力介导的MSC成骨分化，目前尚没有研究[8]。在本研究中，对牵张应力刺激下的MSC成骨分化能力及其lnc-RNA表达谱进行检测，现报道如下。

材料与方法

一、主要材料与仪器

1.主要材料：DMEM培养基、0.25﹪胰蛋白酶-EDTA（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；CBA蛋白定量试剂盒（康为公司）；碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成公司）；PBS缓冲液、RIPA蛋白提取液、Percoll分离液、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水、多聚甲醛溶液（碧云天公司）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、茜素红染色试剂盒（美国Sigma公司）； Trizol提取液（美国Life公司）；cDNA逆转录试剂盒（日本TAKARA公司）；Affymetrix mRNA+长链非编码RNA表达谱芯片（美国Life公司）；FlexCell 6孔细胞培养板（美国FlexCell公司）；离心 管（15 ml、50 ml）、25 cm2培养 瓶、96 孔板（美 国Corning公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。

2.仪器：生物安全柜、CO2恒温培养箱、低温高速离心机、Nano分光光度计、酶标仪、PCR仪（美国Thermo Fisher公司）；FlexCell细胞牵张应力系统（美国FlexCell公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000 （美国Affymetrix公司）。

二、方法

1.正常MSC体外分离、培养：本研究获得中山大学附属第八医院伦理委员会审批通过，所有骨髓捐献志愿者均知晓本研究操作所具有的全部风险，并签署知情同意书。

本研究共募集6名骨髓捐献正常志愿者，其中男3人、女3人、年龄（25.6±3.4）岁，排除禁忌症后按照标准方法行骨髓穿刺术。穿刺成功后抽取骨髓5 ml，加入50 ml离心管中，并加入10 ml PBS缓冲液充分混匀。随后将稀释的骨髓样本用注射器缓慢加入等量Percoll分离液，保持两者液面稳定。以500×g离心10 min，离心后可见两液相界面有白色膜状层。用移液器吸取中间白膜层，加入10 ml PBS缓冲液充分混匀，以500×g离心10 min，离心后可见细胞团块沉淀于离心管底部。用含10﹪胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，进行细胞计数后以2×106个/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中，放置于37 ℃、5﹪CO2细胞培养箱中培养。48 h后弃去培养瓶中培养基，用PBS缓冲液轻轻摇晃，洗去未贴壁细胞，加入新的含10﹪胎牛血清的DMEM培养基继续培养。此后每3天换液1次，当细胞达到80﹪～ 90﹪融合时，0.25﹪胰蛋白酶-EDTA消化传代，第3代细胞用于进行下一步实验。MSC分为应力组与非应力组，应力组为接受应力刺激的MSC，无应力组为未接收应力刺激的对照MSC。

2.成骨分化诱导与牵张应力刺激：第3代MSC培养达90﹪融合时，按上述方法进行消化、计数，以1×105个/孔的密度接种于FlexCell 6孔板中，待细胞完全贴壁后换为成骨诱导培养基（含10﹪胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松的DMEM），放置于37℃、5﹪CO2环境下的FlexCell细胞牵张应力系统进行培养，牵张应力设置条件为5﹪形变、频率0.1 Hz、作用时间为每天4 h。此后每3天全量更换成骨诱导培养基至相应实验时间。

3.茜素红染色与定量：MSC在牵张应力刺激下进行成骨诱导至相应时间点，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻清洗3次，随后用4﹪多聚甲醛溶液在室温下孵育固定5 min。弃去多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液清洗3次，每孔加入茜素红染色液2 ml，于室温下染色10 min。染色完成后加入PBS缓冲液3 ml，于摇床上缓慢清洗5 min（3次），洗去非特异性染色与杂质，于倒置相差显微镜下拍照记录。拍照完成后，每孔加入1 ml的氯化十六烷基吡啶萃取液，于摇床上室温孵育1 h，充分萃取染色。用移液器吸取200 μl萃取液加入96孔板中，于酶标仪下测定吸光度。

4.碱性磷酸酶活性测定：MSC诱导至10 d后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻清洗3次每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl，冰上放置30 min。随后吸取蛋白裂解液，于4℃下以3 000×g离心10 min。按照试剂盒方法配置碱性磷酸酶反应液，于96孔板中每孔加入反应液100 μl，同时加入蛋白上清30 μl，37 ℃孵育 15 min。随后每孔加入显色液 150 μl，充分混匀后通过酶标仪测吸光度。部分离心后的蛋白上清通过BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，对碱性磷酸酶进行标准化定量。

5.RNA提取：牵张应力刺激下MSC成骨诱导至第7天，用PBS缓冲液轻轻清洗3次。每孔加入Trizol提取液1 ml，充分混匀后于冰上裂解5 min。将裂解液转移至无酶EP管中，每管加入三氯甲烷200 μl，剧烈震荡混匀后静置 5 min，随后 3 000×g离心10 min。离心后吸取上层水相液体并转移入新的无酶EP管中，每管加入等量异丙醇，室温静置10 min后于3 000×g离心10 min。离心后可见RNA团块沉淀于EP管底部，弃去上清液，加入75﹪乙醇1 ml充分混匀进行洗涤，以1 500×g离心10 min。弃去75﹪乙醇，加入20 μl无酶灭菌水。于Nanodrop紫外分光光度计下检测RNA浓度与纯度。

6.cDNA逆转录：按照逆转录试剂盒方法，取无酶 EP 管，每管加入逆转录试剂 2 μl、RNA 8 μl，于PCR仪中以37 ℃孵育15 min。逆转录后cDNA加入40 μl DEPC水进行稀释备用。

7.表达谱芯片检测：逆转录完成的cDNA经过标记、芯片杂交、清洗、染色、扫描，收集数据后采用AGCC等软件进行分析，实验方法按照既往文献报道方案进行[8]。实验完成后使用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件对杂交图片进行分析并提取数据，然后使用 Agilent GeneSpring 软件对数据进行归一化和差异分析。

8.生物信息学分析：对差异表达的mRNA进行 KEGG（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）信息学分析汇总，筛查差异表达的相关信号通路。根据序列相似性和表达相关性进行比对分析，鉴定lnc-RNA与mRNA共表达子集。通过NCBI-Blast程序比对共表达子集的lnc-RNA和mRNA的序列相关性。

三、统计学分析方法

采用SPSS 13.0软件进行统计，茜素红定量、碱性磷酸酶活性结果以表示，成骨 0天、14天应力组与无应力组的茜素红定量、碱性磷酸酶定量结果采用两样本t检验进行比较，以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、牵张应力促进MSC成骨分化

将MSC接种于胶原I孵育的6孔板中，置于FlexCell细胞牵张应力系统，在5﹪形变、0.1 Hz、4 h/d条件下进行成骨诱导，发现应力刺激下的MSC在成骨诱导第10天碱性磷酸酶活性达（265.3±31.2） U/L，而无应力组MSC成骨诱导第10天碱性磷酸酶活性仅为（121.2±21.2） U/L，应力组高于无应力组，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。此外，成骨诱导第14天应力组MSC茜素红染色较无应力组MSC加深，应力组MSC茜素红定量OD值达1.46±0.19，无应力组MSC茜素红定量为0.62±0.08，应力组高于无应力组，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。这提示牵张应力可以促进MSC成骨分化（图 1）。

图1 应力刺激下MSC成骨分化能力观察（茜素红染色，×40）

二、牵张应力刺激下MSC成骨分化mRNA和lnc-RNA表达谱

在成骨诱导第7天，分别提取无应力组与应力刺激组MSC的RNA进行全基因组mRNA+lnc-RNA表达谱芯片实验。通过实验，发现差异表达的mRNA共有598个，其中上调的mRNA有313个、下调的mRNA有285个（图2A），差异表达的前5 位的mRNA详见表1。此外，发现差异表达的lnc-RNA有329个，其中上调lnc-RNA有151个，下调的lnc-RNA有178个（图2B），差异表达的前5位的lnc-RNA详见表2。对差异表达的lnc-RNA进行分类，其中基因间lnc-RNA有92个、内含子lnc-RNA有64个、正义链lnc-RNA有84个、反义链lnc-RNA有61个，双向lnc-RNA有28个。这些结果提示应力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表达谱发生显著改变，从而影响其成骨分化能力。

表1 差异表达的前5位的mRNA

表2 差异表达的前5位的lnc-RNA

三、差异mRNA和Lnc-RNA的生物信息学分析

为了探讨差异mRNA相关的信号通路及其对应功能，进行KEGG生物信息学分析。通过分析，发现有5个信号通路的表达变化具有统计学意义，分别为WNT/β信号通路、Cytokine-Cytokine receptor信号 通路、Cell Cycle信号 通 路、Focal Adhesion信号通路和Lipoic acid metabolism 信号通路。WNT信号通路是差异表达最显著的信号通路，共有11个差异表达基因，其中WNT5a上调最为明显（6.74倍）（表 3）。

图2 应力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表达谱

为了探讨WNT5a表达上调的机制，以WNT5a的表达和序列为基础，与差异表达的329个lnc-RNA进行共表达相关性分析和序列比对分析。通过分析，发现有3个差异表达的lnc-RNA与WNT5a具有共表达相关性，分别为 ENSG00000237298.2、ENSG00000241956.5 和ENSG00000187229.3（表4）；通过序列对比分析，结果提示ENSG00000237298.2序列中与WNT5a的编码序列有部分结合位点，提示WNT5a可能是受到ENSG00000237298.2表达调控的靶基因，将ENSG00000237298.2命 名 为lnc-RNA-SSR（long non-coding RNA Strain Stimulation Related）。 这 些结果提示在应力刺激下，lnc-RNA-SSR的表达增加，从而上调WNT5a表达、促进MSC成骨分化。

表3 KEGG分析差异表达信号通路

表4 与WNT5a共表达的lnc-RNA分析

讨 论

1974年，国外学者Friedenstein等[9]首次证实在骨髓微环境中存在成纤维细胞样、长梭型细胞，并将其命名为间充质干细胞（MSC），这些细胞作为骨髓微环境壁龛细胞，具有支持造血干细胞的重要功能。随后的研究发现，MSC广泛存在于人体多种组织中，除了在骨髓中含量丰富之外，还存在于脂肪、脐带等多种结缔组织和外周血循环中[1]。新近研究显示，MSC不仅具有强大的免疫调节能力和较低的免疫原性，还具有多项分化的功能，可以分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞。近年来，一系列的实验均证实，MSC是人体内成骨细胞的主要来源[3]。MSC强大的成骨分化功能使其可以广泛应用于骨折修复、损伤重建等组织再生工程中，具有广泛的应用前景[4]。

机械应力是一种广泛存在于人体中的物理刺激信号，而牵张应力是其中最重要的一类机械应力刺激。牵张应力存在于所有细胞微环境中，主要由肌肉产生并直接作用于骨骼，直接对骨骼相关细胞的增殖、凋亡和分化等功能产生重要影响，从而影响局部骨组织骨量[10]。当人体处于低牵张应力情况下（失重、长期卧床），则会导致骨量降低；而当人体处于高牵张应力、骨组织载荷增加情况下（运动员），则会增加机体骨量[11]。这主要是由于牵张应力影响MSC成骨分化所决定的。MSC的成骨分化能力受到环境刺激、炎症因子等多种因素的影响。大量实验结果表明，适当增加牵张应力刺激可以促进MSC成骨分化，牵张应力预刺激下MSC移植后组织修复能力增强，大大提高了其在组织工程修复中的作用[12]。进一步深入探讨牵张应力刺激调控MSC成骨分化功能的机制，对于推动MSC临床应用意义重大。

在本研究中，通过茜素红和碱性磷酸酶实验，进一步证实5﹪形变、0.1 Hz、4 h/d条件下牵张应力刺激可以促进MSC的成骨分化能力，这与既往文献报道的结果一致[12]。此外，笔者也对不同牵张应力刺激条件进行摸索，发现过强的牵张应力刺激会大量诱导MSC凋亡，从而影响其成骨分化。这与临床观察中，适当的应力或受力可以促进骨折愈合，但是过大过强的应力刺激则会导致骨折延迟愈合的现象一致。此外，笔者进一步对成骨诱导分化后、牵张应力刺激下的MSC进行全基因组表达谱芯片分析。经过分析，共发现对比无应力组，牵张应力刺激下MSC共有598个基因差异表达，其中上调的有313个、下调285个。笔者进一步对差异表达的基因进行生物信息学分析，结果发现差异表达的基因汇聚后共有5个信号通路存在异常表达，分别为WNT信号通路、Cytokine-Cytokine receptor信号通路、Cell Cycle信号通路、Focal Adhesion信号通路和Lipoic acid metabolism 信号通路，提示这些信号通路是牵张应力介导MSC成骨分化能力增强的关键。

WNT信号通路是介导MSC成骨分化的重要通路之一。已有研究证实，WNT信号通路激活可以促进MSC成骨分化[13]。WNT5a是WNT家族的一员，作为外分泌分子，WNT5a主要发挥激活WNT通路的作用，广泛调控机体内的多种细胞，参与组织发育、肿瘤生长等多种生理和病理过程[14]。既往已有研究提示WNT5a可以促进MSC成骨分化[12]。在本研究中，发现WNT5a上调达6.74倍，为差异表达倍数最明显的第二位基因。笔者推测，牵张应力刺激导致MSC自分泌WNT5a增加，从而激活WNT信号通路，导致MSC成骨分化能力增强。

长链非编码RNA是近年来研究的热点，是一种长度大于200 nt、不具备编码蛋白质能力的RNA片段。lnc-RNA包括基因间、内含子等多种类型，存在于细胞核内或细胞质中，可以在转录和转录后水平调控多种细胞的功能[7]。已有研究发现lnc-RNA对MSC成骨分化的功能发挥调节作用[8]，但在牵张应力下MSC的lnc-RNA表达是否发生改变、是否参与了对MSC成骨分化功能的调控，目前尚未见研究。在本研究中，对成骨诱导分化后、牵张应力刺激下的MSC进行lnc-RNA表达谱芯片分析，发现牵张应力刺激后MSC的lnc-RNA表达谱发生差异改变，差异表达lnc-RNA达329个，提示lnc-RNA参与了牵张应力介导MSC成骨分化的过程。

lnc-RNA可以通过多种方式参与基因表达调控，但是发挥调控功能需具备2个前提：一是lnc-RNA与靶基因具有表达相关性，即具有共表达关系；二是lnc-RNA需存在与靶基因可能结合的位点[15]。基于上述两个条件，笔者对以目标基因WNT5a作为核心进行共表达分析和序列比对分析，以进一步明确具体调控牵张应力刺激下MSC成骨分化的关键lnc-RNA。本研究发现lnc-RNASSR在牵张应力刺激下上调达4.11倍，且其表达与WNT5a的表达具有相关性，这说明2个分子之间存在明显的表达联系。进一步通过生物信息学分析，发现lnc-RNA-SSR与WNT5a编码序列有部分预测结合位点，这个结果提示lnc-RNASSR可能与WNT5a的mRNA序列结合。已有许多研究发现，lnc-RNA可与基因的转录本进行结合，对其发挥转录后修饰与调控作用，从而影响其表达水平[15]。笔者推测，lnc-RNA-SSR可能通过直接结合WNT5a编码序列，以调控其表达水平改变，这需要在未来的研究中通过实验进一步证明。此外，本研究虽还发现ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3与WNT5a有共表达关系，但由于生物信息学预测提示二者之间不存在结合位点，提示 ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3仅仅是成骨过程中伴随出现的转录本，不对WNT5a进行调控。

综上所述，在本研究中进一步证实牵张应力刺激下MSC的lnc-RNA表达谱发现明显变化、成骨分化能力显著增强。这可能是由于lnc-RNA-SSR表达上调，通过特异性调控WNT5a自分泌增加，从而介导WNT信号通路激活，最终导致MSC成骨分化增强。本研究探索了lnc-RNA表达谱在牵张应力介导MSC成骨分化中的作用，对于促进MSC特异性分化及在组织再生工程中的应用，具有重要意义。然而，本研究尚有不足，具体lnc-RNA-SSR调控WNT5a表达及WNT信号通路激活的机制尚未完全阐明，仍需要再未来的研究中进一步探索。