CAR-NK治疗肿瘤的研究与临床进展

刘兵 周美龄 刘韬

肿瘤治疗是现代医学面临的一项重大挑战。肿瘤免疫细胞治疗是一种新兴的特异性强、副作用小并具有广阔发展前景的治疗方法。2017年7月，诺华嵌合抗原受体 T（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）细胞产品被美国FDA正式批准上市，并在之前的临床研究中展现出对血液瘤良好的治疗效果。相较于CAR-T疗法，自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）作为效应细胞具有很多优良特性。首先，不会像T细胞一样产生移植物抗宿主反应（graft- versus- host disease，GVHD）现象，有望成为通用型细胞治疗手段；其次，NK细胞不受抗原特异性组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制，具有更强的杀伤能力；再次，NK细胞表面CD16低亲和力分子可与靶细胞表面IgG 抗体复合物介导ADCC作用；NK细胞也可通过Fas/ FasL途径介导细胞凋亡，释放细胞因子[1]。综合上述优点，使用NK细胞改造的嵌合抗原受体NK（chimeric antigen receptor NK-cell，CAR-NK）细胞将更有应用前景。本文对CAR-NK目前研究的进展及临床初步应用成果进行了总结，为下一步在实体瘤应用提供依据。

一、CAR-NK体系的构建

CAR-NK构建是通过基因修饰手段，人为的构建一条NK细胞活化通路从而特异性增强NK细胞抗肿瘤效果。目前为止，在CAR-T构建基础上，根据NK细胞特性设计出了较为完善的CAR构建途径。

（一）CAR结构

CAR主要包括抗原结合区、跨膜区、胞内信号区三大基本构造。根据胞内区域的不同，CAR结构已经发展到目前的第三代[2]（图 1）。

1.抗原结合区及跨膜区：抗原结合区决定CAR-NK的特异性和靶向性，该部分由单克隆抗体抗原结合区scFv构成，与靶细胞表面的特异性抗原结合，从而识别肿瘤细胞。目前为止，已有多种靶点展开临床试验，如CD19[3]，CD20[4]，CS1[5]，EGFR/EGFR Ⅷ[6]，ErBb2/HER2-[7]，CD3[8]，CD138[9]等（表1）。跨膜区的作用是将胞外的信息传递到胞内，现在最常见的为CD3ζ跨膜序列，HLA-A2以及CD8也越来越多的作为跨膜序列应用[10]。

2.胞内信号区：胞内信号区结构至关重要。该区域决定着活化信号的强弱，直接影响杀伤效果。第一代CAR结构使用CD3ζ做为胞内段。它由3个免疫受体酪氨酸激活基序构成[11]。在第一代的基础上串联入1个或2个激活结构域，如：CD28，CD137，41BB等，形成第二代和第三代CAR结构（图1）。靶向CD19的第一代CAR-T与第二代对比，加入CD28信号分子的第二代CAR-T性能要更加稳定[12]。CD28/CD3ζ共刺激信号，对NK细胞同样有效。有研究显示，具有CD28/CD3ζ共刺激信号的CAR-NK注射入多发性骨髓瘤荷瘤小鼠模型体内，可以检测到NK细胞的活化并能抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存周期[5]。

图1 嵌合抗原受体结构

表1 用于NK细胞基因修饰的CAR结构

虽然由CAR-T的设计思路演化而来的二代CAR激活信号在CAR-NK的构建早期得到延用，但是DAP12，FcεRLγ是NK细胞特有的活化受体，其效率更高。在最新的研究中，将仅有一个免疫受体酪氨酸激活基序的DAP12[13]作为胞内域，融合PSCAscFv抗原区修饰NK细胞系YTS后，可以增加IFN-γ的分泌，在动物实验中也起到抗肿瘤效果[13]。因此利用NK细胞自身相关激活元件设计的CAR预计能更好地在体内激活NK细胞。

NK92是广泛应用的NK稳定细胞系，该细胞系相比于原代NK细胞缺乏杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer immunoglobulin-like receptor，KIR）抑制受体，一直处于活化状态，因此构建CAR结构的时候引入“开关”装置，是降低其潜在副作用的一个优化策略[14]。

（二）载体选择

CAR-NK的特异性杀伤取决于抗原结合区，跨膜区以及胞内信号域的相互作用，当CAR基因在细胞的增殖以及生长过程中可以持续稳定表达才能保证上述功能有序的进行。因此表达载体在CAR-NK的构建中显得尤为重要。

CAR-NK在构建过程中需要克服转染这一技术难关。传统构建方法有电转染法、脂质体转染法、钙转染法以及病毒转染法。病毒载体具备传送其携带的基因组进入其他细胞并进行感染的分子机制，具有感染及表达率高的优点。目前常见的可以用来转染NK细胞的病毒基因载体主要包括：逆转录病毒（retrovirus，Rv）、腺病毒（adenovirus，Adv）、慢病毒（lentivirus，Lv）、腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）、仙台病毒（sendaivirus，SeV）等（表 2）。逆转录病毒以及慢病毒是CAR-NK构建过程中比较常用的载体。Imai等[28]在研究中发现，用逆转录病毒转染原代NK的效率为43﹪～ 93﹪。电转染法相比于慢病毒转染构建的CD19/ CD20 CAR-NK，电转染的效率＜ 10﹪，慢病毒转染外周血来源的NK的效率为8﹪～ 16﹪，对于脐带血来源的NK效率为12﹪～ 73﹪[10]。仙台病毒在CAR-NK 的临床级研究还未见报道。

二、NK效应细胞的来源

NK细胞可以有多种来源（表3）：外周血，脐带血，人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）以及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。

（一）干性细胞来源的NK细胞

人胚胎干细胞以及诱导多能干细胞分化而来的NK细胞已经开始广泛研究。脐带血在体外分化扩增的NK细胞已经向临床转化[29]。2017年6月份，MD Anderson癌症中心利用脐带血诱导分化出NK细胞，并进行嵌合抗原受体改造，用于治疗复发或者耐药性慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL），急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）或非霍奇金淋巴瘤已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期阶段。另有研究表明，体外用iPSC以及hESC分化而来的NK细胞用CD4-CAR修饰，在体外有良好的抗HIV感染的功能[30]。加州大学最新研究报道，IPS诱导分化而来的NK细胞在经过CAR改造后，可以抑制卵巢癌模型小鼠体内肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期[31]。这种方式获得的NK细胞纯度较高，是一种较好的NK来源。

（二）自体外周血来源

过去的十几年，在外周血中已经可以高效分离并扩增临床级NK细胞。这种方法获得的NK细胞已经用于急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）的治疗试验[32]。原代NK细胞的表面表达KIR，该受体是维持NK细胞功能的关键。因此异体移植的NK细胞与受体患者的HLA-Ⅰ类分子不相符，NK细胞会保持持久的杀伤效果[33]。但是，在外周血中分离得到的细胞需要检测T细胞以及B细胞的含量，防止GVHD现象以及EB病毒相关的恶性淋巴组织增生性疾病的产生[32]。

表2 常见CAR-NK构建使用病毒载体特性

表3 NK细胞来源

（三）NK稳定细胞系

相比于以上两种NK细胞来源，NK细胞系的获得更为方便快捷。现有的NK细胞系有NK92，KHYG-1，NKL和YT等。其中NK92细胞系应用最为普遍。NK92细胞系是1992年从1例50岁的非霍奇金氏淋巴瘤男性患者体内分离得到。该细胞系的生长呈IL-2依赖性[34]。NK92细胞系的表型为 CD56bright/CD16neg/low，低表达 CD3，CD8，高表达NKG2D活化受体以及天然细胞毒性受体：NKp30和NKp46[35]，以及一系列和细胞毒有关的分子如穿孔素以及颗粒酶B。NK92细胞系的表面缺乏KIR，因此该细胞系可以维持良好的活性。KHYG-1，NKL和YT等细胞系的CD16呈现低表达，是非常理想的治疗效应细胞。

NK92细胞系对于血液肿瘤的杀伤效果已经证实，相比于T细胞，NK细胞对实体瘤的杀伤效果也非常显著，如黑色素瘤以及乳腺癌。而且发现其对健康的外周血单核细胞以及骨髓细胞没有毒性作用[36]，关于NK92在临床上的安全性评价也已经开展（NCT00990717，NCT00900809，NCT02465957；https://clinicaltrials.gov）。但是，目前 NK92细胞系的体内安全性尚未得到广泛的认可，有学者担心其在体内的成瘤性。

三、CAR-NK的应用

目前为止，CAR-NK在临床前的研究中对血液系统瘤以及实体瘤的治疗中均表现出良好的效果。

（一） CAR-NK在血液瘤中的治疗效果

近年来，CAR-T在血液病的治疗中取得了不错的成果。因此人们也首先将CAR-NK的着眼点放在了血液瘤。Romanski等[37]构建的 NK-92-scFv（CD19）- CD3ζ可以增强对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤，并且可以克服NK细胞抑制现象。Boissel等[38]构建的 CD19/ CD20―CAR- NK，注射入免疫缺陷小鼠创建的CLL病模中，肿瘤细胞得到了有效的清除起到了治疗效果，而且进行改造的CAR-NK依然可以发挥ADCC的作用。这些成果都展现了CAR-NK的良好前景。

（二） CAR-NK在实体瘤中的治疗效果

CAR-T细胞在抗击实体肿瘤的过程中，由于自身程序性死亡受体（programmed cell death protein 1，PD-1）的表达以及肿瘤细胞表面PD-L1的表达，导致出现免疫抑制现象。NK细胞表面PD-1表达很低，相对受肿瘤微环境免疫抑制小，也许是抗击实体瘤的良好候选者。目前，CAR-NK对于实体瘤的治疗逐渐展开。Han等［6］以CD28/CD3ζ为信号域融合EGFR抗原区构建的CAR-NK92细胞系，在体内外对胶质瘤取得了较强的杀伤效果。并且另有研究发现ErBb2-CAR修饰的NK92细胞对HER2表达阳性的乳腺癌以及卵巢癌细胞系有较强的杀伤作用，在体内也可以抑制肿瘤的生长[39]。用CD28/ CD3ζ融合CS1改造CAR-NK对于CS1+的MM细胞有很强的杀伤能力，并且在体外还能促进IFN-γ的分泌。CS1-CAR-改造的 NK-92细胞抑制 MM肿瘤生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期[5]。关于c-Met，FAB，GD2，WT1，PSMA，NY- ESO-1相关抗原改造的 CARNK也有报道，均表现出不错的抗肿瘤效果。

（三）临床应用

近年来，CAR-NK的临床前研究进展明显，但是在临床实验的研究进程中，则慢于CAR-T的研究。至今已经开展多项NK的肿瘤细胞免疫治疗，但是仅有两项CAR-NK项目在临床上开展。最早展开的是在孟菲斯的圣尤达儿童研究医院，在这项研究中，于供体中分离得到NK细胞，将表达IL-15以及41BB的K562细胞辐照以后与NK细胞共培养（滋养层法），然后进行CD19-CAR的改造后回输回患者体内（ClinicalTrails.gov.NCT00995137）。另一项进入临床阶段的项目在新加坡国立大学医院进行（ClinicalTrails.gov.NCT01974479），该项目用IL-2与供体NK细胞共培养进行扩增，进而进行CD19-CAR的改造，然后回输给成年ALL患者进行治疗。这两项临床研究，代表着CAR-NK项目的巨大进展，也预示着良好的前景。与CAR-T一样，CAR-NK也率先在血液肿瘤上开展，对于实体瘤治疗需要加快研究的脚步。同时，在将此疗法推广入临床Ⅲ期前，对于质量监管的问题仍需要进一步的阐明规范。例如NK体外培养扩增阶段的问题，尽管NK细胞的分离技术，扩增以及转染等技术已经较为熟知，但整个过程还处于科研级，临床级研究较少。因此对CAR-NK副作用的评价；自体来源NK涉及到KIRs导致的失活问题；异体来源的NK纯度问题导致的GVDH现象以及转染过程中载体所引发的安全问题等仍需进一步的明确。

对于CAR-NK的上述总结，发现其与CAR-T项目相比，在许多方面的优势相对突出。对于上述各方面，笔者将两种疗法进行系统性的对比（表4）。

四、CAR-NK疗法发展的挑战与解决策略

近些年来对NK的细胞生物学，免疫学，以及记忆性NK细胞的研究和认识越来越深入[40-41]，而且对于NK细胞的免疫相关受体的信号通路等也有了新的研究[41]。越来越多的研究为NK细胞在免疫治疗中的应用奠定了良好的基础。在上文中对CAR-NK免疫疗法进行了系统性的介绍，但是一些潜在的挑战也仍需解决。

（一）脱靶效应

CAR-NK虽然是选取特异性强的抗原进行CAR的改造，但是也无法保证选取的抗原完全不在正常组织中表达。因此，理论上存在正常组织被CAR-NK攻击的风险。 如在CAR-T疗法的研究中，CD19-CAR-T在进行淋巴瘤的治疗过程中，同时对CD19+的正常B细胞也会存在杀伤作用[42]。但目前为止关于CAR-NK的临床研究较少，脱靶相关副作用的评价暂时未有报道，而且在相关动物实验中，也没有相关副作用的评价。

表4 CAR-T与CAR-NK比较

表5 NK细胞用于肿瘤治疗临床案例

在肿瘤发生的过程中，肿瘤细胞也会存在新的突变等，但是肿瘤细胞周围的基质细胞在肿瘤发生发展中起着关键性的作用，且基因表达稳定，故选择这类基质细胞作为杀伤对象从而间接地对肿瘤产生影响，以应对肿瘤细胞基因的不稳定突变可能是一种新的策略。

（二）关于转染载体

对于CAR-NK免疫疗法来讲，转染效率问题是最为重要的问题。现在运用慢病毒以及逆转录病毒进行CAR- NK的修饰改造，在NK细胞系的转染效率较高[43]，因此仍需努力对转染载体进行积极的探索，进而提高转染效率，将这些技术高效的运用于外周血来源的NK细胞改造中。伴随着转染的进行，一系列关于载体的风险也随之而来。如病毒载体的容量问题，是否会引发机体的免疫反应等问题都需要在今后的临床前以及临床研究中进一步的评估。

（三）免疫因子风暴

众所周知，CAR-T在研究中发现，T细胞通过大量的免疫因子来发挥抗肿瘤效果，因而免疫风暴是影响其发展的制约因素之一。尽管NK细胞在激活过程中不分泌IL-6，且参与的免疫因子较少，但是在活化过程中也会分泌大量的IFN-γ和肿瘤坏死因子等。因此，CAR-NK细胞治疗的免疫因子风暴问题也需重视。在临床运用过程中，应当注意细胞制剂的使用量，亦或通过配合使用药物来避免免疫风暴的发生。另外，吸取CAR-T细胞设计的经验，在CAR-NK细胞中加装安全开关也是一个流行的趋势。

2016年Roybal等[44]在CAR-T系统中引入人为改造的Notch系统，人为影响细胞的凋亡。这些方法都可以提示对NK细胞进行相关改造避免类似不良反应发生。

（四）改造所需的NK细胞相关问题

由于NK细胞自身的构造等原因，现有关于NK细胞的临床研究中发现自体或者异体的NK细胞直接用于肿瘤治疗的效果不明显。如表5所示，总结几例用于临床的NK细胞项目进行对比。这些肿瘤治疗对象包含了实体瘤以及血液瘤。在这些治疗过程中，可以发现NK细胞系的治疗效果以及安全性相对优于原代NK细胞。这可能是因为病患自身的NK细胞杀伤性受到抑制，导致免疫逃逸现象的发生。鉴于此，异体NK细胞会是更好的CAR-NK细胞来源。但异体外周血来源则会由于NK细胞纯度问题存在着GVDH风险。

目前，对于开发细胞治疗药物来讲，NK92细胞系是较优的选择，既保持细胞毒作用，并且扩增简便、缩短治疗周期，同时也降低了成本。但是这种永生化细胞系的安全性仍需进一步探索[45]。按照目前国家对于细胞免疫治疗按药物管理的原则，CAR-NK作为细胞药物，其生产、运输也将是需要面临的重要产业化问题。

随着CAR技术的不断进展，为肿瘤免疫治疗打开了一扇新大门。这种技术可以促使肿瘤免疫治疗更加个体化和特异化，使得治疗更加精准。目前，CAR-T技术已经广泛用于肿瘤治疗。在免疫系统中NK细胞抗肿瘤能力以及临床应用的潜力强于T细胞，所以CAR在NK细胞上的应用在理论上是可行的，且有足够的临床前研究支持这样的方案。目前CAR-T疗法在血液肿瘤的治疗中展现出卓越的效果，但对实体瘤的作用不尽人意。相比T细胞杀伤肿瘤细胞的机制，NK细胞具备更多杀伤肿瘤细胞的途径，因此在实体瘤的应用方面有更好的预期。在CAR-NK的研发中，应当努力突破实体瘤治疗的难关。NK细胞来源广泛，最大的优点是有成熟的细胞系，如NK92，可以弥补患者自身免疫细胞弱化的缺点，还可以提高治疗的通用性，更适合作为细胞药物进行开发。CAR-NK免疫疗法的周期更快，可以改变免疫细胞疗法的繁杂现象即“off-the-shelf”概念。这一系列的优势更利于CAR-NK疗法的工业化生产，质量控制更加有保证，为其成药性提供了巨大的可能性。