云南地区不明原因猝死心肌CD8+T细胞表达及心肌电镜观察

孙仲春，付　华，贾彭林，杨启琨，瞿勇强，雷普平

不明原因猝死(sudden unexpected death,SUD)是指经法医病理解剖、组织学检验及常规毒药物检验后仍不能明确死亡原因的猝死。不明原因猝死是当前法医学领域研究的热点问题之一。统计发现有1%～5%的死亡通过法医学系统尸体检验不能得出明确死亡原因[1]。在云南地区还存在着一类特殊的不明原因猝死类型，该猝死主要发生在云南一些偏远山区、半山区，具有明显的家族或家庭聚集性、空间聚集性和时间聚集性等特点，被学者称为云南不明原因猝死(yunnan sudden unexplained death,YNSUD)[2]。YNSUD自1978年首次报道以来，先后有20多个县的50多个乡镇报告了400余例猝死病例[3]，因其死因不明，无有效的治疗和预防措施，已成为严重的社会问题和法医学鉴定难点[4]。有学者通过常规的HE染色观察认为，部分YNSUD就是暴发性心肌炎。然而，心肌炎性损伤较为轻微的YNSUD通过常规的HE染色观察并不能明确认定为心肌炎[5]。为探明云南地区不明原因猝死与心肌炎之间的关系，本研究对YNSUD心肌、散发性SUD心肌进行免疫组织化学染色，检验CD8+T细胞在心肌的表达情况，同时对YNSUD病例的心肌组织进行扫描电镜观察，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料本研究样本均来自昆明医科大学司法鉴定中心2013年至2015年，经鉴定为不明原因猝死病例29例(其中包括5例为YNSUD、24例为散发性不明原因猝死)，所选案例均经过常规HE染色后，光学显微镜下检查未达到诊断心肌炎标准，其他均未发现异常。正常心肌对照组9例。免疫组织化学检验所用抗体(mouse anti-CD8)、SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。2例死后20 h解剖提取的YNSUD病例心肌组织进行扫描电镜观察。

1.2方法免疫组织化学检验：心肌样品取材→包埋组织→切片→贴片→脱蜡→水化→抗原修复→血清封闭→加一抗→加二抗→显色剂→复染→脱水→封片→显微镜观察。扫描电镜观察：心肌样品取材→固定→脱水→干燥→粘样→镀膜→扫描电镜观察。

1.3结果判定标准本研究按许良中的判断标准：先将染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。再将阳性细胞所占的百分比评分：阴性为0分，阳性细胞簇10%为1分，11～50%为2分，51～5%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分为免疫反应阳性[6]；通过光学显微镜进行判断定性，每个高倍视野≥5个炎性细胞或淋巴细胞为心肌炎，<5个为炎性细胞或淋巴细胞浸润[7]；扫描电镜结果由两位专家分别进行观察判断。

2　结果

2.1免疫组织化学结果29例不明原因猝死病例中有2例散发性不明原因猝死心肌CD8+T细胞表达呈阳性，8例有淋巴细胞及单核细胞浸润但无CD8+T细胞表达(其中YNSUD 1例，散发性不明原因猝死7例)但未达到心肌炎诊断标准；9例正常心肌对照组均为阴性，见表1、图1。

表1　29例不明原因猝死心肌情况　例

A:YNSUD心肌组织;B:散发SUD心肌组织;C:散发SUD心肌组织;D:散发SUD心肌组织呈炎性改变。图1　心肌组织中CD8+T细胞表达情况(HE,×100)

2.2心肌电镜扫描结果2例YNSUD者心肌超微电镜观察得到的心肌超微结构未发现细胞间质中血管、心肌细胞的病理性改变，见图2。

A:心肌间质自溶性改变；B:心肌肌原纤维自溶性改变；C:心肌肌原纤维自溶横切面；D:心肌肌原纤维自溶横切面。图2　心肌肌原纤维电镜扫描图

3　讨论

心肌炎性损伤较为轻微的病变如何明确认定为心肌炎是目前猝死心脏病病理研究的一个难点。有学者通过对云南地区不明原因猝死尸体解剖及病理组织学光学显微镜检查表明，48%病例具有局灶性心肌炎改变[8,10,13]，但对其他无明显炎性细胞浸润的不明原因猝死是否存在心肌炎性损伤尚无研究报道。研究发现CD8+T淋巴细胞是免疫反应的效应细胞[8]，可介导细胞毒性作用，CD8+T细胞在病毒性心肌炎小鼠心肌组织浸润的炎性细胞中所占的百分率与心肌组织病理积分及心肌细胞凋亡率均呈显著正相关，与心肌细胞炎性损伤密切相关，可作为心肌炎性损伤的一个重要检测指标[9]。

本研究通过检测CD8+T细胞在云南地区不明原因猝死者心肌组织中的表达，结果有2例散发性不明原因猝死心肌CD8+T细胞表达呈阳性，表明其存在心肌炎性损伤，虽不能诊断为心肌炎，但其心肌炎性损伤可能与其死亡原因相关。本研究中5例YNSUD均未发现CD8+T细胞表达阳性，提示YNSUD与心肌炎无明确相关性。8例淋巴细胞及单核细胞浸润表明心肌存在炎性反应应答，而淋巴细胞是特异性免疫功能的重要组成部分，淋巴细胞在抗感染免疫中发挥重要作用[9]，本研究中8例不明原因猝死心肌存在不同程度的淋巴细胞及单核细胞浸润，提示不明原因猝死可能存在轻微心肌炎性反应。本研究扫描电镜观察，心肌组织主要呈自溶性改变，未发现其他病理性改变，其原因主要可能与检查没有在死者死亡后及时提取和送检有关。扫描电镜观察需要机体死亡后立即取材与送检，结合本研究结果及法医病理尸体检验时通常都要死后数小时才能进行，故扫描电镜观察结果可能受自溶性改变影响较大。

YNSUD发病迅猛、病情变化快、突然死亡、病死率高，多数学者认其应为心源性猝死[10]。本研究中云南地区不明原因猝死者心肌CD8+T细胞的表达，仅在散发性不明原因猝死者心肌组织中存在CD8+T细胞，提示CD8+T细胞可能与心肌损伤的发生、发展存在联系，可能与猝死的机制有关[11]。但是，这尚不能解释云南地区不明原因猝死的发生机制，尤其是YNSUD的发生还可能与心脏离子基因变异、局灶性心肌炎、不明原因毒物(小白菌)中毒等多种原因相关[12-19]，有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]Tester DJ, Medeiros-domingo A, Will ML,et al.Cardiac channel molecular autopsy:insights from 173 consecutive cases of autopsy-negative sudden unexplained death referred for postmortem genetic testing[J].Mayo Clin Proc,2012,87(6):524-539.

[2]李中平,刘孝柏,宋先毅,等.云南不明原因猝死[J].中国医学创新,2009,6(5):104-105.

[3]Vincent GM, Timothy K, Fox J,et al.The inherited long QT syndrome:from ion channel to bedside [J].Cardiol Rev,1999,7(1):44-55.

[4]王红月,赵红,宋来凤,等.29例云南不明原因聚集性猝死的尸检病理学研究[J].中华医学杂志,2007,87(31):2209-2214.

[5]吴秋萍.中国南方人群青壮年猝死的流行病学调查及致基因筛[D].广州:中山大学,2016.

[6]许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229-231.

[7]胡祥新.心肌炎的组织病理学诊断标准及其在法医病理学中的应用[J].中国法医学杂志,1998,13(2):124-126.

[8]范彦琦,何瑞玲,覃炳军.淋巴细胞亚群对病毒性心肌炎患者生存率的预测价值[J].中国医学创新, 2017, 14(19):8-11.

[9]郭春艳,韩波.CD8+T淋巴细胞在病毒性心肌炎发病机制中作用的研究[J].临床儿科杂志,2007,25(10):812-813.

[10]王长虹,黄文丽,杨林.云南不明原因猝死的概况[J].现代预防医学,2008,35 (19):3867-3868.

[11]刘婧,古力娜尔·库尔班,热沙来提·艾米多,等.CD8+T淋巴细胞、颗粒酶B在人类病毒性心肌炎细胞凋亡中的作用[J].热带医学杂志,2013,13(10):1199-1201.

[13]Watanabe H,van der Werf C, Roses-Noguer F,et al.Effects of flecainide on exercise-induced ventricular arrhythmias and recurrences in genotype-negative patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia[J].Heart Rhythm,2013,10(4):542-547.

[14]Kauferstein S, Kiehne N, Erkapic D,et al.A novel mutation in the cardiac ryanodine receptor gene (RyR2) in a patient with an unequivocal LQTS[J].Int J Cardiol,2011,146(2):249-250.

[15]王红月,黄文丽,杨崇福,等.云南不明原因聚集性碎死中心肌炎病例的病理特点分析[J].中华病理学杂志,2007,36(12):805-809.

[16]黄京璐,郝博,王小广,等.中国汉族人群不明原因猝死与NOS1AP基因多态性的相关性[J].法医学杂志,2014,30(1):27-30.

[17]Zheng J,Zhou F,Su T,et al.The biophysical characterization of the first SCN5A mutation R1512W identified in Chinese sudden unexplained nocturnal death syndrome[J].Medicine,2016,95(23):3836.

[18]王云云.RYR2基因G1885E,G1886S位点多态性与不明原因心脏性猝死的相关性探索[D].武汉:华中科技大学,2013.

[19]杨进刚.约三分之一的不明原因猝死为离子通道病所致[J].心血管病学进展,2007,28(2):203-204.