芍药苷对深Ⅱ度烫伤诱导的肝损伤小鼠肝组织Bax、Caspase-3表达的影响

韩玉芳，张　玮，苏瑜恒，张　洁，张　伟，路　瑶

芍药苷(paeoniflorin，PF)是从中草药芍药中提取的化合物，在药物化学分类中属于单萜类糖苷化合物[1]。近些年来，大量基础研究提示芍药苷具有一定的药理作用[2]。烫伤是日常生活和战时常见且复杂的外伤疾病，烫伤可导致休克、组织器官缺血缺氧，进一步损伤肝肾肺等实体器官[3]。近几年，中药成分用于烫伤所致脏器损伤是研究热点之一[4]。作者通过研究芍药苷对深Ⅱ度烫伤诱导的肝损伤小鼠肝组织谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)水平和Bax、Caspase-3表达，为烫伤所诱发的肝损伤防治提供依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验用品与试剂组织蜡块切片机(德国Leica公司)，芍药苷(西安昊轩生物科技有限责任公司)，ALT与AST试剂盒(艾美捷科技有限公司)，兔源单抗Bax、Caspase-3(美国CST公司生产)，ABC免疫组化试剂盒(天津麦兰波公司)，DAB组化显色试剂套装(天津麦兰波公司)。

1.2实验动物雄BABc小鼠30只，体质量25～30 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，在SPF级条件下饲养。

1.3动物建模与用药30只BABc小鼠随机分为3组，每组10只，分别为对照组、模型组、芍药苷组。对模型组、芍药苷组小鼠进行Ⅱ度烫伤处理：实验前使用100 g·L-1硫化钠背部去毛，采用水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉小鼠，采用90 ℃热水烫伤小鼠皮肤，造成占15%体表总面积的深Ⅱ度创面[5]。芍药苷组则在建模前按60 mg·kg-1芍药苷进行灌胃1次。

1.4样品采集与处理烫伤后12 h处死小鼠，并取血与肝组织，检测ALT与AST 水平变化情况。肝脏固定于4%中性甲醛溶液中，按病理科实验程序制作组织石蜡切片，然后进行HE染色与免疫组化标记Bax、Caspase-3表达与定位。

2　结果

2.1小鼠ALT与AST水平变化与对照组比较，烫伤处理后的小鼠血清 ALT与AST 水平显著上升，两组间差异有统计学意义(P<0.05)；而芍药苷组经芍药苷提前预处理后，小鼠血清ALT与AST水平与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，芍药苷组小鼠血清 ALT与AST 水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　芍药苷对损伤小鼠ALT与AST的影响(n=10)　U/L

注：①与模型相比较：P<0.05。

2.2小鼠肝组织病理变化在HE染色中，与对照组相比，烫伤处理后小鼠肝脏组织出现细胞水肿，部分区域可见坏死，且坏死诱发炎性细胞浸润，损伤程度明显，较严重区域可见肝小叶结构遭受破坏。而芍药苷预处理后小鼠肝脏组病理学改变明显减轻，肝小叶结构较完整，见图1。

2.3肝损伤小鼠Bax、Caspase-3表达对3组小鼠肝组织进行免疫组化染色，光镜下可见肝脏细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，此着色间接体现为Bax、Caspase-3表达阳性。Bax与Caspase-3蛋白在对照组小鼠肝组织中呈低表达，而烫伤处理后的小鼠肝组织Bax、Caspase-3表达增高；芍药苷预处理的小鼠肝组织Bax、Caspase-3表达均有不同程度减少，结果提示芍药苷可抑制深Ⅱ度烫伤诱导的肝损伤小鼠肝组织Bax、Caspase-3表达，见图2。

图1　小鼠肝组织病理变化(HE，×400)

图2　小鼠肝组织Bax、Caspase-3 表达(免疫组化染色,×400)

3　讨论

严重烫伤后各器官会发生不同程度的缺血缺氧损伤[6]，若不及时治疗 ，会产生大量氧自由基、炎性介质等有害物质[7-8]，损害各器官功能[9-10]。ALT与AST 主要存在于肝细胞中，当肝细胞受损时血中含量增加；深度烫伤可引起肝细胞损伤，且ALT与AST释放入血增加[11]。结果显示，烫伤后的小鼠血清 ALT与AST 水平显著上升，而芍药苷组经芍药苷提前预处理后，小鼠血清ALT与AST水平与模型组比较显著减少；与对照组比较，芍药苷组小鼠血清 ALT与AST 水平差异无统计学意义。与对照组相比，烫伤处理后小鼠肝脏组织出现细胞变性与坏死，坏死诱发炎性细胞浸润，损伤程度明显，较严重区域可见肝小叶结构遭受破坏；而芍药苷预处理后小鼠肝脏组织损伤改变减轻，肝小叶结构较完整。实验结果表明，芍药苷可有效减轻深Ⅱ度烫伤诱导的肝损伤。

机体内外各种因素上调Bax表达，均能促进机体内细胞凋亡或细胞坏死[12]。Caspase-3作为蛋白水解酶类，可涉及细胞信号传导及细胞死亡的执行[13]，当机体遭到复杂因素刺激时，Caspase-3则转为活性片段Cleave Caspase-3，激活凋亡的级联反应[14]，诱导细胞凋亡或死亡[15]。免疫组化结果表明，对照组小鼠肝组织Bax、Caspase-3低表达，模型组小鼠肝组织Bax、Caspase-3阳性表达明显增多，而芍药苷组小鼠肝组织Bax、Caspase-3表达程度均有不同程度降低。经芍药苷干预的小鼠血清 ALT与AST含量明显减少，小鼠肝脏组织病理学结果得到明显改善，肝小叶结构较完整，提示芍药苷可有效减轻深Ⅱ度烫伤诱导的肝损伤，其机制可能与降低Bax、Caspase-3表达以抑制肝细胞凋亡有关。

参考文献：

[1]徐唯哲,赵妍,秦一,等.低氧与常氧状态下芍药苷在大鼠体内的药代动力学比较[J].国际药学研究杂志,2016,43(2):336-340.

[2]郑世存,李晓宇,欧阳兵,等.芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒,2012,9(2):100-103.

[3]王彦博,姚咏明,王强,等.血必净注射液对烫伤大鼠高迁移率族蛋白B1表达和急性肝损伤的影响[J].中华烧伤杂志,2009,25(3):171-175.

[4]夏建国,项尽一,王晖,等.异丙酚对严重烫伤兔的肝保护效应[J].中华麻醉学杂志,2015,35(7):834-836.

[5]王忠堂,姚咏明,盛志勇,等.休克期切痂对烫伤大鼠肝HMGB1表达及肝功能的影响[J].中华急诊医学杂志,2004,13(12):823-825.

[6]王少根,徐慧芹,陈侠英.党参对严重烫伤豚鼠肠道的保护作用[J].中国中西医结合急救杂志,2005,12(3):144-145.

[7]宋学敏,王焱林,李建国,等.电针足三里对严重烫伤致大鼠急性肺损伤的影响[J].中华麻醉学杂志,2010,30(4):469-472.

[8]邵庆波,章雄,陈雪莲,等.冬眠合剂对严重烫伤大鼠早期肺组织的保护作用[J].上海交通大学学报(医学版),2010,30(11):1338-1342.

[9]张家平,黄跃生,周新,等.严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡与心功能损害的关系[J].中华烧伤杂志,2002,18(5):272-275.

[10]张昆,夏建国,项尽一,等.异丙酚对兔严重烫伤并发肺损伤的保护作用[J].中华实验外科杂志,2015,32(12):3211.

[11]胥阳,宋学敏,李建国,等.电针足三里对严重烫伤大鼠凝血功能和血浆促炎性细胞因子的影响[J].武汉大学学报(医学版),2012,33(4):453-456,461.

[12]杨连君,曹雪涛,于益芝.bcl-2,bax与肿瘤细胞凋亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(3):232-234.

[13]梁乐,冷慧,郭彦科,等.雷帕霉素靶蛋白病中Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达及其意义[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(11):1239-1244.

[14]李永宁,肖晶晶,赵建勇.Caspase-3及Cleaved-Caspase-3在氟中毒大鼠肝脏中表达[J].贵州医药,2016,40(3):239-240.

[15]毛德文,陈月桥,王丽,等.Caspase-8及Caspase-3与细胞凋亡[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(10):148-150.