AML对柔红霉素的耐药性与TET2基因突变的相关性

杨 柳，葛 健，夏瑞祥

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML) 是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度异质性，以骨髓原始细胞的异常增殖和分化为特征，化疗是其最主要的治疗手段之一，但因原发或继发耐药的原因而导致治疗失败率居高不下。目前有研究[1]表明，表观遗传学异常，如DNA甲基化可影响白血病细胞对化疗药物的敏感性。研究[2-3]显示TET2基因突变与造血系统恶性肿瘤密切相关，并在诊断、治疗和预后评估中具有潜在价值。Viguié et al[4]在4例AML患者中发现4q24上的基因重排，通过BAC克隆和荧光原位杂交显示4q24断裂处0.5Mb的缺失区域。Delhommeau et al[5]首次报道了在骨髓增殖性疾病患者中染色体4q24的杂合缺失，TET2基因突变最早发现于JAK2V617F阳性的骨髓增殖性疾病中，后来在系统性肥大细胞症，骨髓增生异常综合症及AML中也有发现。该研究利用高通量二代测序及体外药敏试验等技术手段，将54种白血病相关基因与AML对于化疗药物耐药性之间的相关性进行探讨，同时将其与临床资料结合，以期找出具有预测发生耐药的特定指标。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2016年1月～12月安徽医科大学第一附属医院血液科初诊AML患者74例，其中男40例，女34例，年龄16～83岁，中位年龄46岁。根据2008年WHO诊断标准将患者分为：AML微分化型(M0)1例，AML未分化型(M1)2例，AML部分分化型(M2)41例，急性粒单细胞白血病(M4)11例，急性单核细胞白血病(M5)16例，急性红白血病(M6)3例。 基因检测时间：初诊治疗前。高通量体外药敏检测试验抽样时间：患者接受治疗前抽取外周静脉血4～8 ml。

1.2单个核细胞分离纯化患者所取样本采用Ficoll密度梯度离心法分离，同时淋巴细胞分离液和细胞培养液RPMI 1640预热至室温。在15 ml离心管中加入适量的淋巴细胞分离液，取肝素抗凝静脉血与2倍量的Hank’s液或RPMI 1640充分混匀，离心。离心后取中间白色云雾层狭窄带单个核细胞层，加入含有20%胎牛血清的RPMI 1640，重悬细胞。

1.3高通量二代测序实验方法分离提纯的单个核细胞进行DNA抽提，NanoDrop鉴定纯度。DNA与探针混合后先加温到95 ℃ 1 min，然后将热模块设到40 ℃让样本探针缓慢降温到40 ℃(大概需要约80 min)。然后，除未杂交上的探针，延伸并连接杂交上的探针进行PCR扩增。利用AMPure XP 纯化PCR完成后的产物并进行质控，上机检测。高通量二代测序实验主要检测54个白血病相关基因，见表1。

1.4体外药物敏感性检测分离、提取的单个核细胞计数后按照1×105～1×106个细胞/1ml在细胞加样槽中充分混匀后，采用Corning 384孔不透明白色细胞培养板进行培养，每孔体积50 μl，细胞数目为5×103～5×104。采用JANUS@ automated workstation (美国Perkin Elmer Inc公司) 进行加药，药物名称见表2, 每孔0.1 μl，给药后37 ℃、5% CO2培养箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 细胞增殖荧光检测试剂，静置10 min，Envision Plate-Reader读数。

表1 基因检测列表

表2 药物筛查列表 (81种)

1.5统计学处理采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1二代测序实验结果74例AML患者中11例发生TET2基因突变，见表3,11例TET2突变患者中有5例患者同时发生ASXL1基因突变,其余63例患者基因检测结果显示均未发现TET2基因突变。

2.2高通量体外药敏实验结果对于81种药物进行检测分析, 表明柔红霉素耐药性最高, 结果显示11例TET2基因突变阳性患者中9例(81.82%)对柔红霉素不敏感，63例TET2基因突变阴性患者中仅4例(6.35%)对柔红霉素不敏感，两组结果差异有统计学意义(χ2=31.805，P<0.05)。在TET2基因突变阳性的11例患者中，10例采用柔红霉素+阿糖胞苷(DA)方案化疗，具体为柔红霉素45 mg/m2第1～3天,阿糖胞苷100 mg/m2第1～7天,1例放弃治疗，3例完全缓解，7例未缓解，耐药率为70%，见表4。体外药敏试验中耐药率与患者未缓解率差异无统计学意义。

3 讨论

TET2定位于染色体4q24的断裂点[6]，在体内广泛表达，编码TET2蛋白，阻止细胞的不可控生长，进而阻止肿瘤形成。TET2突变能使TET2蛋白功能丢失，从而导致造血干细胞异常的增殖和分化。近几年在多种血液恶性疾病中发现TET2基因突变。TET2常见的突变类型有错义突变，无义突变，移码突变及短小插入缺失等[6]。TET2突变最常发生于外显子3和11，突变位置与TET酶的功能结构域紧密相关，在催化结构CD和DSBH的突变会引起蛋白质的错误折叠和氨基酸的替换，产生无功能蛋白，从而导致肿瘤形成[7]。目前研究[8]推测TET2突变主要分为两类：一类为在骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生异常综合征和继发性急性髓系白血病中的突变，预后意义尚不明确；另一类为在慢性粒-单核细胞白血病和原发性急性髓系白血病中的突变，此类突变具有强致病性和侵袭性，可直接影响患者预后。在一项对原发性AML的大规模研究中，Metzeler et al[9]发现TET2的突变率为23%，随年龄增长，TET2突变率增加。更重要的是研究发现核型正常的AML患者，若伴有TET2突变则预后不良。Abdel-Wahab et al[10]检测了91例AML患者，其中11例发生TET2突变，突变率为12%，而且发现TET2突变患者5年生存率显著低于无突变患者。Cher et al[11]发现72例AML患者中有8例发生TET2突变，突变率11%，且无病生存率减低。Nibourel et al[12]发现111例完全缓解的AML患者中有19例检测到TET2突变，36例没有完全缓解的AML患者中有19例检测到TET2突变。这些研究结果也表明TET2突变可以作为临床AML危险分层的新的生物学标志。魏计锋 等[13]在96例患者中检测到13例TET2突变，突变率为13.54%。本研究对74例AML患者中54种白血病相关基因进行高通量测序，TET2基因突变率相对较高，11例患者存在该突变，突变率为14.86%，与国内外研究[10-13]结果相似。另外，这11例患者中有5例伴有ASXL1突变。ASXL1基因定位于染色体20q11,编码一个长为1 541个氨基酸的核蛋白，参与组蛋白甲基化调控。在AML中，ASXL1突变易发生在老年男性患者，并与8号染色体三倍体、RUNX1突变及HLA-DR和CD34的表达相关，该基因与耐药性的产生是否具有相关性，仍需进一步研究明确。

表3 11例TET2患者基本信息

表4 11例TET2患者基因突变及用药信息

为了明确TET2基因突变与白血病患者耐药性产生之间的相关性，本研究随后使用74例AML患者外周血进行体外药敏试验，检测其对于常见化疗药物的敏感性，结果显示对柔红霉素耐药的比例最高。柔红霉素是蒽环类化疗药物，是周期非特异性化疗药物，具有较强的抗肿瘤性，并在AML中有较高的完全缓解率和较低的复发率，且与其他蒽环类药物无交叉耐药现象，半衰期长。柔红霉素联合阿糖胞苷联合化疗方案目前临床诱导治疗AML的主要方案之一，其中柔红霉素起着重要作用。目前几乎所有的一线标准方案中都含有柔红霉素[14]，其作用机制在于影响细胞的核酸合成，与DNA结合，阻碍DNA合成和依赖DNA的RNA的合成反应。DNA拓扑异构酶Ⅱ是其重要靶点。DNR干扰拓扑异构酶Ⅱ将DNA断端重新接合，造成DNA损伤，导致细胞凋亡[15]。目前报道[16]显示，临床正在使用柔红霉素时，也有部分患者出现柔红霉素耐药。其耐药机制尚不明确，可能与NF-κB异常活化、IκB降低，致使细胞内耐药基因P-gp/mdrl等的表达增多有关。多项研究[17]结果显示，柔红霉素疗效存在一定的个体差异。目前认为表观遗传学可能影响柔红霉素的疗效，如DNA甲基化，组蛋白修饰，microRNA 的表达等都影响了机体对柔红霉素的反应，成为研究热点，而且在临床治疗中也确实存在使用柔红霉素方案疗效欠佳。在本研究中，11例TET2基因突变阳性患者中，有9例对柔红霉素不敏感，而63例TET2基因突变阴性患者中仅有4例对柔红霉素不敏感，差异有统计学意义，这表明有TET2基因的突变可能有助于患者对柔红霉素产生耐药性。由于体内肿瘤微环境等因素的影响，可能体外试验并不一定与药物的实际临床疗效完全等同，因此，本研究又同时将11例TET2基因突变阳性患者对于DA方案的实际疗效与体外药敏试验进行对比，由于1例患者未行化疗，因而无法对其判断疗效，仅将另外10例患者的体外药敏试验与实际临床疗效进行对比，结果显示差异无统计学意义。

根据本研究结果，推测TET2基因突变可能确实增加了AML对柔红霉素产生耐药性的风险。然而，由于本研究中TET2基因突变阳性的患者数较少，导致本研究的结果具有一定的局限性，将会在今后的研究中进一步提高样本数，明确是否在大样本的研究中能够得到相同的结果。本研究为今后的工作提供了一个方向，可以建立动物模型，研究发生机制，使基因检测与药敏实验更好结合，对精准医疗，尤其是急性白血病个体化治疗提供依据，从而提高治疗的有效率，有较高的临床指导意义及应用前景。

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