应用酵母双杂交系统筛选LKB1相互作用蛋白

徐 卿，李洪涛，林 峰，姚 阳

LKB1(liver kinase B1)即STK11(serine/threonine protein kinase 11)，首次是在黑斑息肉综合征研究中被报道的[1]，其在胰腺、肝脏等机体器官组织中广泛表达。LKB1基因可编码一个由436位氨基酸组成的蛋白质，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，N端第38～43位氨基酸残基是其核定位信号序列、第50～319位氨基酸为其激酶催化域。LKB1通过核定位信号序列主要定位于细胞核内，在胞质中表达相对较少，然而LKB1的功能主要与其胞质内的部分有关[2-3]。研究[4-5]显示，LKB1通过磷酸化其底物腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)，从而激活AMPK，负向调节mTOR的活性，在控制和调节细胞能量代谢、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞极性中发挥着重要作用。为更清楚了解LKB1在体内的作用机制，揭示LKB1可能存在的新功能，该研究利用酵母双杂交系统，以LKB1为诱饵，筛选人类全基因组开放阅读框酵母双杂交文库，寻找能与之相互作用的蛋白。

1 材料与方法

1.1试剂与材料GAL4酵母双杂交系统与human ORFeome Y2H library文库、转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Yeast Nitrogen Base、Bacto-yeast extract、Bacto-Peptone 购自美国BD公司；PEG50、葡萄糖、醋酸锂、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase,GST)及GST融合蛋白、各种氨基酸购自上海拜科生物科技公司；3-氨基-1，2，4-三唑、玻璃珠购自美国Sigma公司；Glutathione Sepharose 4B beads购自上海轶沤生物科技有限公司；质粒小量提取试剂盒购自美国Promega公司；酵母质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Tag酶、DNA限制性内切酶购自美国NEB公司；T4DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司；XgaI、DMEM高糖培养基与胎牛血清购自美国Gibco公司；增强化学发光显色试剂盒购自美国Pierce公司；Mav203细菌感受态为实验室保存。

1.2方法

1.2.1构建Bait质粒 LKB1全长克隆到pDONR221载体，通过Gateway cloning reaction (美国Invitrogen公司)转移到含有GAL4 DNA binding domain的pDEST32载体，构建Bait载体pDEST32- LKB1，用LiAc转化法将pDEST32-LKB1转化入Mav203酵母菌株，转化成功的菌株通过SD-leu的培养基选择性筛选阳性克隆，将转化了pDEST32- LKB1的酵母菌株制成感受态细胞。

1.2.2自激活检测 用LiAc转化法将含有GAL4 activating domain的prey质粒空载 (pDEST22)转化含有Bait基因的感受态细胞，转化后同时涂布二缺板SD-2(SD-Leu-Trp)和4缺板SD-4(SD-Leu-Trp-His-Ura)的营养缺陷板，如果能在SD-4上生长说明有自激活效应，该Bait蛋白能与GAL4 activating domain相互作用。没有自激活效应再进行下一步筛选。

1.2.3文库筛选 用LiAc转化法将prey质粒(human ORFeome Y2H library)转化该菌株，转化后同时涂布SD-2和SD-4的营养缺陷板，SD-Leu-Trp的培养板可以用于转化效率的评估，阳性克隆可以在SD-4的培养板上生长并且使X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside,美国Sigma公司)显蓝色，抽取酵母阳性克隆质粒转化大肠杆菌，抽质粒测序，确定阳性克隆基因。

1.2.4克隆验证 将Bait和Prey载体共同转化酵母菌株Mav203并分别涂布SD-2和SD-4酵母培养板，X-Gal显色反应验证相互作用。将回转阳性的质粒送上海铂尚生物技术有限公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心网站上进行序列比对分析。

1.2.5HERC3真核表达载体构建 以含HERC3全长cDNA为模板通过下游带有HA标签的引物，运用PCR方法扩增HERC3全长序列( 正向引物:5′-CGGAATTCATGTTATGTTGGGGATATTG-3′；反向引物: 5′-ATGAAGGGTTTAGTTTGGCCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAACTCGAGCGG-3′)。PCR产物经过EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，与pcDNA3.1(+)载体用T4 DNA连接酶在16 ℃的条件下连接过夜。然后将连接的产物转化摇菌，用小抽试剂盒抽提质粒，PCR鉴定正确后送至上海铂尚生物技术有限公司测序。

1.2.6细胞培养及转染 HEK293FT细胞在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基中培养。待细胞生长状况良好时，胰酶消化并接种培养皿中，当细胞密度生长至70%～80%时，换成无双抗的Opti-DMEM培养基培养，并用Opti-DMEM培养基将Lipofectamine2000以及质粒以1 ∶1的比例混匀，室温孵育20 min，再均匀加入相应培养皿中，转染4～6 h后换为含10%胎牛血清、0.1%青霉素和链霉素的DMEM 高糖培养基继续培养。

1.2.7免疫共沉淀 ① 收集细胞，加500 μl细胞裂解液RIPA buffer (添加PMSF) 裂解细胞。② 裂解细胞于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液。其中需另外留取50 μl上清液，加入5×SDS样品缓冲液，煮沸10 min，-20 ℃保存留作Input的样品。③ 免疫共沉淀：加入1 μg抗体，4 ℃充分混匀4 h或者过夜。再加入20 μl用细胞裂解液平衡过的protein G beads，4 ℃充分混匀4 h。1 000 r/min离心3 min，弃上清液。加1 ml细胞裂解液，4 ℃轮转10 min, 1 000 r/min离心3 min，弃上清液，重复洗涤3次。④ Western blot检测：吸尽上清液，加60 μl 1×SDS样品缓冲液，煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液电泳，Western blot检测沉淀及共沉淀蛋白质。

1.2.8GST-Pull down 按照实验组别分别加入GST-LKB1融合蛋白(对照组用GST蛋白)和过表达HERC3的细胞裂解液，然后分别加入等量Glutathione Sepharose 4B beads，并补充GST-Pull down buffer 到总体积500 μl。4 ℃充分混匀4 h后，GST-Pull down buffer漂洗3次，煮样，Western blot检测沉淀蛋白。

1.3统计学处理数据采用 SPSS 16.0软件进行分析，两组间实验数据的比较采用t检验。

2 结果

2.1E3连接酶HERC3能够与LKB1蛋白相互作用利用已有的cDNA文库，采用酵母双杂交方法筛选到HERC3能与LKB1相互作用。HERC3属于E3连接酶，含有染色体浓缩调节因子1相似结构域和同源E6-AP羧基末端结构域。HERC3与LKB1的相互作用能够使酵母在4缺板SD-4(SD-Leu-Trp-His-Ura)上生长，并能够激活β-galactosidase活性。见图1。

图1 酵母双杂交系统检测LKB1与HERC3有相互作用

A:HERC3+LKB1共转并在SD-2上生长; B: Blank+LKB1共转并在SD-2上生长；C: HERC3+LKB1共转并在SD-4上生长; D: Blank+LKB1共转并在SD-4上生长；蓝色为阳性克隆

2.2pcDNA3.1-HERC3-HA真核表达载体的构建及鉴定构建成功的重组质粒pcDNA3.1-HERC3-HA经过PCR检测鉴定，经过DNA Marker比对后，显示与目的片段条带位置一致，证明连接是成功的。然后送测序，序列与基因库序列一致，质粒构建成功。见图2。

2.3HERC3与LKB1在细胞内的相互作用采用免疫共沉淀的实验方法，将带有Flag标签的LKB1和带有HA标签的HERC3质粒共转染HEK293FT细胞，同时分别设置pcDNA3.1-Flag +pcDNA3.1-HERC3-HA和IP：IgG作为阴性对照。结果表明，HERC3和LKB1结合，而不与Flag标签结合，说明HERC3和LKB1蛋白在细胞内存在特异性的相互作用。见图3。

图2 重组质粒pcDNA3.1-HERC3-HA PCR鉴定电泳图

A:DNA Marker; B：以cDNA文库为模板PCR方法扩增HERC3；C：重组质粒PCR鉴定HERC3条带

图3 HERC3与LKB1在HEK293FT细胞内的相互作用

1:LKB1-Flag; 2: HERC3-HA+pCDNA3-Flag共转; 3: HERC3-HA+LKB1-Flag共转

2.4GST-Pulldown验证HERC3与LKB1的相互作用以GST-LKB1融合蛋白为诱饵蛋白,过表达HERC3的细胞总蛋白为捕获蛋白,分别设置HERC3-HA+GST蛋白组、HERC3-HA+GST-LKB1融合蛋白组，进行Pull-down实验,最后收集到的样品进行Western blot检测沉淀蛋白。结果表明，GST-LKB1能够特异性结合HERC3，而GST蛋白不能够沉淀HERC3。见图4。

3 讨论

目前研究[6]表明，LKB1参与体内多种生物学过程：① LKB1能够抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期在G1期；② LKB1能够抑制mTOR通路的活性，减少细胞内蛋白合成；③ LKB1在细胞的极性调控中发挥着关键性作用。Wilkinson et al[7-8]发现，LKB1通过和STRAD蛋白形成复合物而活化后，能够在没有细胞间连接和其他极性诱导因素的条件下，使单个的小肠上皮细胞自发性形成顶-基极性。

图4 GST-Pull down验证HERC3与LKB1的相互作用

A: HERC3-HA+GST蛋白；B: HERC3-HA+GST-LKB1融合蛋白

近年来有大量研究[9-10]表明，LKB1不仅仅是PJS的致病基因，也是多种肿瘤发生的重要基因，如肺癌、乳腺癌、胃癌等，LKB1在肿瘤的发生、分化、转移中发挥至关重要的作用，在前列腺癌中LKB1通过AMPK通路发挥其抑癌作用；在乳腺癌中，LKB1-AMPK通过作用于mTOR发挥其抑癌作用。

HERC3作为同源E6-AP羧基末端结构域家族的泛素连接酶E3，可以直接催化靶蛋白的泛素化。已有研究[11]显示，在胃癌、结肠癌中HERC3存在突变。HERC3与hPLIC-1和hPLIC-2相互作用并定位于晚期内涵体和溶酶体[12]。HERC3通过其E3连接酶功能泛素化并促进NF-KB RelA降解，进而负调NF-κB信号通路[13]。

泛素化修饰属于蛋白质翻译后修饰的一种，通过泛素-蛋白酶系统介导参与的调节蛋白质降解的过程，普遍存在于真核细胞中。泛素化修饰对于蛋白质的稳定性、亚细胞定位及信号转导过程等具有重要的调节功能。其中泛素连接酶E3决定了底物识别的特异性并最终催化底物蛋白的泛素化过程。HERC3属于膜转运所涉及的E3泛素连接酶家族，主要分布在胞质。该家族一般包含一个同源E6-AP羧基末端结构域和一个或多个染色体浓缩调节因子1相似结构域(RCC1-like结构域)， LKB1在胞质也有分布，而且LKB1的主要功能也与其胞质部分相关[14]。

对于LKB1在疾病中的确切分子机制目前仍未明确，本研究采用酵母双杂交方法成功筛选出HERC3与LKB1在体内存在相关作用，同时利用免疫共沉淀实验以及GST-Pull down实验分别在体内外对二者的相互作用进行进一步验证。结果显示LKB1在体内外均可以有效地结合HERC3，说明了其相互作用的可靠性。提示HERC3有可能通过与LKB1特异性的结合进而影响LKB1所参与体内多种生物学过程。对于HERC3可能涉及或参与调控LKB1作用的方式还有待于进一步的研究与探索，可能对肿瘤的诊断治疗、为药物开发提供靶点及理论指导具有一定的意义。

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